自動QuEChERS結合氣相色譜－串聯質譜法測定花生中297種農藥殘留

蔣康麗，扈 斌，吳興強，謝瑜杰，李鐵梅，范春林，王明林，王雯雯，陳 輝*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.山東農業大學 食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；3.安捷倫科技（中國）有限公司，北京 100102）

花生是我國重要的油料作物和經濟作物，花生出口已成為我國經濟發展以及對外貿易的重要產業［1］。然而由于花生病蟲害、環境污染、種植方式改變等因素，花生的農藥使用量越來越大，農藥殘留超標嚴重影響花生品質及食用安全，限制了我國花生出口貿易的發展，給我國經濟帶來不利影響［2］。但花生基質成分復雜，脂肪含量高，同時含有蛋白質、脂肪酸和糖類等成分，如何有效去除基質干擾，成為花生等油料作物農殘檢測工作中亟需解決的問題［3－4］。

自動QuEChERS前處理設備是一款由自動程序控制分析樣品制備的設備，通過配套試管的聯合使用（外管提取，內管凈化），將樣品提取與凈化整合一體完成，極大提高了樣品的前處理效率［5］。王濟世等［6］利用自動QuEChERS法檢測玉米中的133種農藥殘留，回收率在70%～120%之間；陳婷等［7］利用自動QuEChERS法檢測大米和馬鈴薯中的34種農藥殘留，回收率為53.0 %～125%，而利用自動QuEChERS檢測花生中農藥多殘留的分析少見報道。

由于農藥大多具有揮發性和疏水性，故高脂肪樣品多選用氣相色譜進行分離，而氣相色譜－串聯質譜因具有靈敏度高、選擇性好、定量能力準確的特點被廣泛應用于農藥多殘留檢測［8－10］。本研究采用自動QuEChERS前處理設備，以PSA/C18/Z－Sep+為分散固相吸附劑，建立了基于QuEChER方法的氣相色譜－串聯質譜快速檢測花生中297種農藥的方法。所選取的297種農藥包括氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、有機氮類、有機氯類、有機磷類和有機硫類等類別，實現了一種技術覆蓋多類別農藥的檢測。參考GB2763－2019《食品安全國家標準－食品中農藥最大殘留限量》中花生最大殘留限量標準所涉及的農藥，本文所檢測的農藥數量多、類別廣，能夠為相關標準制定提供依據［11－12］。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent7890A－7000B氣相色譜－三重四極桿串聯質譜儀（美國Agilent公司）；QuEChERS自動樣品制備系統Sio-6512（北京本立科技公司）；自動QuEChERS整合管（包括外管和凈化內管，北京本立科技公司）；N-112氮吹濃縮儀（美國Organomation Associates公司），TRIOTM－1N渦旋攪拌器（日本Asone公司），Milli-Q超純水機（美國Millipore公司），PL602－L電子天平（瑞士Mettler－Toledo公司），超聲波清洗器（中國江蘇昆山超聲儀器有限公司）。

297種農藥標準品（純度≥95%，天津阿爾塔公司）；乙腈（色譜純，美國Honeywell公司）；PSA、C18吸附劑（天津Bonna－Agela公司）；Z－Sep+（美國Supelco公司）；EMR－lipid（美國Agilent公司）。實驗用水均為高純水（經Milli-Q超純水器純化）。

1.2 標準溶液的配制

各稱取10mg標準品于10mL容量瓶中，用甲醇準確定容至刻度，配制成1000mg/L的單標儲備液，于－18℃下保存。從1000mg/L的單標儲備液中各取100μL于10mL棕色容量瓶中，配制成10mg/L的混標貯備液，－18℃下保存。按需取適量標準儲備液，配制成所需濃度的標準工作液，于4℃避光儲存。

1.3 樣品制備與提取凈化

將花生仁用料理機粉碎，混勻，備用。準確稱取2.00 g樣品于配套試管的外管中，加入2mL水浸潤30min后，加入15mL1%（體積分數）醋酸乙腈、4g硫酸鎂、1g乙酸鈉和12顆鋯珠，將凈化內管（內管中含100mg PSA，100mg Z－Sep+，200mg C18，400mg無水硫酸鎂和6顆鋯珠）置于外管中，振蕩混勻后放入自動QuEChERS前處理設備，設置提取振蕩程序進行處理。待處理完成后，取內管上清液2mL，在氮氣氣流下吹至近干，使用1mL乙酸乙酯定容，過0.22 μm濾膜，供GC－MS/MS測定。

1.4 色譜－質譜條件

色譜柱：HP－5MS UI氣相色譜柱（30m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司）；載氣流速為1.2 mL/min；載氣：氦氣，99.999 %；柱溫：初始溫度40℃，保持1min，以30℃/min升溫至130℃后，再以5℃/min升溫至250℃，最后以10℃/min升溫至300℃，保持8min；進樣口溫度：250℃；進樣方式：不分流進樣；溶劑延遲：4min；EI離子源溫度：270℃；EI源電離能量：70eV；傳輸線溫度：280℃；四極桿溫度：150℃；碰撞氣：高純氮氣（99.999%）；掃描模式：多重反應監測（MRM）模式。檢測離子對及掃描時間見表1，297種農藥殘留的總離子流圖見圖1。

圖1 花生中297種農藥的總離子流圖（0.1 mg/kg）Fig.1 Total ion chromatogram of297pesticides（0.1 mg/kg）in peanut

表1 297種農藥的保留時間、MRM參數、線性范圍、相關系數（r2）、花生基質的加標回收率（100μg/kg）和相對標準偏差（RSDs，n=6）及定量下限（LOQ）Table1 Retention times，MRM parameters，linear ranges，correlation coefficients（r2），recoveries（100μg/kg）and RSDs（n=6），and limits of quantitation（LOQs）of297pesticides

（續表1）

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2 結果與討論

2.1 提取條件優化

2.1.1 提取溶劑種類優化花生基質成分復雜，提取劑在保證目標農藥提取效率的同時應盡可能減少共萃物的萃取，減少基質干擾。乙腈通用性強，滲透性好，能有效降低油脂蛋白質和糖分的干擾［13］，已成為應用廣泛的農藥多殘留提取劑。在乙腈作用下，某些堿敏感型農藥易發生降解［14］，因此需在乙腈中加入適量醋酸調節pH值。本文考察了純乙腈、1%（體積分數，下同）醋酸乙腈和2%（體積分數，下同）醋酸乙腈對花生中目標農藥的提取效率，實驗發現，以1%醋酸乙腈為提取劑時，目標農藥回收率在70%～120%范圍的數量高于乙腈和2%醋酸乙腈（圖2），因此本實驗選擇1%醋酸乙腈作為提取試劑。

圖2 目標農藥在3種不同提取劑中的回收率Fig.2 Recoveries of target pesticides with three different extract solvents

2.1.2 提取溶劑用量優化提取劑的用量會對目標農藥的回收率造成一定影響。本文分別比較了1%醋酸乙腈用量為10、15、20mL時，花生中目標農藥的加標回收率情況。結果表明，用量為15mL和20mL時，目標農藥回收率在70%～120%范圍內的占比分別為74.5 %和72.5 %，均高于10mL時的占比（70.2 %）。最終選擇1%醋酸乙腈的體積為15mL進行提取。

2.2 緩沖鹽用量的優化

由于花生大多為干制品，水分含量較低，用1%醋酸乙腈提取時，不能很好地滲透到樣品組織內部，導致部分農藥回收率較低。因此，在提取過程中通常會加入一定量的水，但水分過多影響凈化效果，且可能對儀器產生損害，而加入緩沖鹽可以起到使水相與有機相分離并去除水分的作用。本文考察了2g硫酸鎂+0.5 g乙酸鈉、4g硫酸鎂+1g乙酸鈉和6g硫酸鎂+1.5 g乙酸鈉3種緩沖鹽方案對花生中297種農藥加標回收率的影響。

結果表明，使用2g硫酸鎂+0.5 g乙酸鈉時，樣品與鹽結合成團狀，不能充分去除樣品中水分，影響目標化合物的提取，且只有52.7 %的目標農藥回收率在70%～120%；使用6g硫酸鎂+1.5 g乙酸鈉時，65.7 %的目標農藥回收率在70%～120%；而使用4g硫酸鎂+1g乙酸鈉時，有83.0 %的農藥回收率在70%～120%范圍，較其它兩種組合回收率提高了30.3 %和17.3 %，因此選擇4g硫酸鎂+1g乙酸鈉作為緩沖鹽。

2.3 凈化劑的優化

2.3.1 凈化劑種類的優化Z－Sep+是二氧化硅鍵合C18和ZrO2兩種吸附劑的混合物，在酸性條件下，對帶有負電荷的油酸、羧酸等陰離子具有很強的吸附作用，除油脂效果更理想［15］。另外，作為一種與Z－Sep+功能相似的吸附劑，增強型脂質吸附劑（EMR－lipid）可通過體積排阻與疏水作用將基質中體積較大且疏水的油脂類化合物分離，從而達到較好的凈化效果［16－17］。

本文以1%醋酸乙腈為提取劑，在固定加入400mg無水硫酸鎂的前提下［7，18］，考察了4種凈化劑組合的凈化效果：（1）100mg PSA+200mg C18；（2）100mg PSA+100mg Z－Sep+；（3）100mg PSA+150mg C18+75mg Z－Sep+；（4）EMR－lipid。

4種凈化劑組合中目標農藥回收率在70%～120%范圍的比例依次為56.2 %、68.2 %、77.1 %和69.6 %，即使用組合（3）時回收率在70%～120%范圍內的農藥數最多。在100μg/kg添加水平下，將上述各凈化劑組合樣品同批次進樣并進行對比，發現加入C18和Z－Sep+時化合物響應明顯高于其他組合。以氯氟氰菊酯、α-六六六為例，其提取離子流色譜圖如圖3所示。因此選擇100mg PSA+150mg C18+75mg Z－Sep+為最優凈化劑組合。

圖3 不同凈化劑組合下氯氟氰菊酯、α-六六六在花生中的提取離子流色譜圖Fig.3 Overlapped extract ion chromatograms of cyhalothrin and α-HCH in peanut sample after cleanup using different sorbents

2.3.2 凈化劑用量的優化采用單因素實驗法進一步優化了C18、Z－Sep+和PSA的添加量。固定加入400mg無水硫酸鎂，分別比較了C18（100、200、300、400mg）、Z－Sep+（50、75、100、125mg）和PSA（50、100、150、200mg）添加量對農藥回收率的影響。結果發現，當使用100mg PSA、200mg C18和100mg Z－Sep+時，目標農藥的回收效果最好。因此，本研究最終采用100mg PSA+200mg C18+100mg Z－Sep+為凈化劑。

2.4 基質效應

基質效應（ME）是指基質引起的檢測信號的增強或者減弱現象，不同農藥所受到的基質效應不同。本研究通過建立一系列基質標準曲線與溶劑標準曲線，按照公式ME（%）=100%×（A－B）/B（A為農藥在基質匹配標準溶液中的響應值，B為農藥在純溶劑中的響應值）進行計算和基質效應評價。ME低于－20%時為基質抑制效應，在－20%～20%之間時為弱基質效應；大于20%為基質增強效應［19］。由圖4可見，共有6種（2.02 %）農藥表現為基質抑制，216種（72.73 %）農藥表現為弱基質效應，75種（25.25%）農藥表現為基質增強。因此本實驗采用基質匹配標準曲線校正，以減弱基質效應對目標化合物定量的影響。

圖4 花生中目標農藥的基質效應Fig.4 Matrix effects（ME）of the test pesticides in peanut matrix

2.5 方法學評價

2.5.1 定量下限在最佳條件下，采用花生的空白基質溶液，準確配制0.6 ～50μg/L的基質匹配標準工作溶液，在GC－MS/MS上進行測定，以峰面積對質量濃度作標準曲線，得到297種農藥的線性回歸方程。各農藥的線性范圍、相關系數和定量下限（S/N=10）結果見表1。從表中可以看出，各農藥在一定質量濃度范圍內線性良好，相關系數均不低于0.995 ，定量下限為2～10μg/kg。

2.5.2 回收率與相對標準偏差選擇花生空白樣品，分別進行10、20、50、100μg/kg4個水平的加標回收實驗，每個水平做6個平行樣品。其平均回收率分別為72.7 %～116%、71.9 %～117%、73.2 %～112%和71.5 %～120%，相對標準偏差（RSDs）分別為0.90 %～15%、0.70 %～15%、0.60 %～14%和0.40 %～15%，滿足農藥多殘留分析的要求。100μg/kg加標水平的數據結果見表1。

2.6 實際樣品測定

應用所建立的方法對市售8批次花生樣品進行檢測，共6批次檢出農藥殘留（表2），其中第2批次樣品檢出9種農藥，為檢出農藥殘留最多的批次，其總離子流圖見圖5。所有樣品中共檢出17種農藥殘留，且百治磷、咪鮮胺和唑禾草靈的檢出頻次較高。總體而言，花生中的農藥整體殘留水平較低。

圖5 檢出9種農藥的花生樣品的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of peanut samples with9pesticides detected No.were the same as those in Table1

表2 花生中農藥檢出情況Table2 Detection results of pesticide residues in peanut

(續表2)

3 結 論

本文在QuEChERS的基礎上對提取和凈化步驟進行優化，聯合PSA、C18和Z－Sep+進行凈化，顯著提高了回收率，并將QuEChERS方法與自動QuEChERS前處理設備結合，極大地提高了工作效率。與傳統QuEChERS方法相比較，本方法在保證回收率與精密度的基礎上，自動化程度更高，處理批量樣品的耗時更短，為快速測定花生中的多農藥殘留提供了有力的技術手段。