MIL－101（Cr）填充針頭式過濾器固相微萃取/高效液相色譜法檢測水中雌激素

鄧鑫雨，魏皓東，龐月紅，史學麗，張 毅*

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，食品學院分析食品安全研究所，江蘇 無錫 214122；2.石家莊市婦幼保健院，河北 石家莊 050051）

內分泌干擾物（EDCs）因其對激素系統的干擾能力而得到廣泛關注［1－2］。近年來，由于大量藥物的生產和使用，越來越多的EDCs通過生產和生活廢物、人類和其他生物的排泄物進入環境中，其中環境雌激素（EEs）種類最多、最受關注。大多數環境雌激素的化學性質穩定、半衰期較長，在生物體內降解速度慢、難以排出體外，并能通過食物鏈等作用在人體內富集，導致毒性蓄積，從而產生致癌、致畸性［3－4］。因此，監測環境中殘留的雌激素具有重要意義。

由于環境樣品的組成非常復雜且環境中雌激素的含量較低，通常需要進行樣品前處理以濃縮分析物和減少干擾物［5］。填充吸附劑微萃取（Micro-extraction by packed sorbent，MEPS）是一種將吸附劑（1～4mg）封載于注射器針筒的小型化固相萃取技術，其吸附劑和有機溶劑用量少、操作簡單、富集因子高、回收率高，已成功用于環境或生物基質中多種分析物的提取［6］。此外，吸附材料也是影響固相萃取效果的關鍵因素之一，與傳統吸附材料相比，金屬有機骨架（MOFs）具有易制備、孔徑可調、比表面積大等優點，自2006年以來被廣泛應用于不同形式的固相萃取中。MIL－101（Cr）是一種以對苯二甲酸鉻為骨架的介孔MOFs，大孔籠（孔窗為12?和14.7 ×16?，內徑為29?和34?）、高孔隙率、大比表面積和良好穩定性使其成為吸附和分離環境樣品中分析物的有前途的候選物［7－8］。

本文以MIL－101（Cr）為吸附劑，在MEPS基礎上，提出一種以帶有微孔濾膜的針頭式過濾器為吸附劑載體的小型化萃取方法——填充針頭式過濾器固相微萃取（SPME－FSF），借助于注射器推動力在濾頭內快速完成萃取、淋洗、洗脫過程，開發了一種簡單、快速、高效、低成本的新型固相微萃取裝置，并結合高效液相色譜－熒光檢測器（HPLC－FLD）實現了環境水中雌二醇（E2）、雌三醇（E3）、雌酮（E1）的萃取和分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

D2PHASER X射線衍射儀（德國布魯克有限公司）；SU8100冷場發射掃描電子顯微鏡（日本日立株式會社）；Autosorb－iQ全自動比表面和孔徑分布分析儀（美國Quantachrome公司）；UV－3600PLUS紫外－可見分光光度計（日本島津公司）；LSP02－1B注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司）。

17β-雌二醇（17β-E2）、雌三醇（E3）、雌酮（E1）、Cr（NO3）3·9H2O、對苯二甲酸（PTA）（上海阿拉丁生物技術有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇、無水乙醇、氫氟酸、鹽酸、氫氧化鈉、溴化鉀（國藥集團化學試劑有限公司）；色譜純乙腈、甲醇（美國Fisher Chemical公司）。所用試劑如未特別說明，均為分析純。0.22 μm尼龍66過濾器（Ameritech Scientific公司）；PTFE過濾器（安捷倫科技有限公司）。湖水樣品取于江蘇無錫小蠡湖；自來水樣品取自實驗室；飲用水樣品為桶裝洞庭山飲用天然泉水，購于蘇州碧螺天然泉食品飲料有限公司。

1.2 MIL－101（Cr）的合成

MIL－101（Cr）的合成參照Férey課題組的水熱合成法［8］：將800mg Cr（NO3）3·9H2O（2.0 mmol）、332mg PTA（2.0 mmol）、9.6 mL水和0.1 mL氫氟酸（40%）超聲分散均勻后于反應釜內220℃反應8h，冷至室溫，離心并用DMF洗滌沉淀至洗滌液無色澄清透明，以除去孔道內的對苯二甲酸及金屬鹽溶液；以無水乙醇洗滌3次，置換孔道內殘留的DMF，40℃真空干燥過夜，得MIL－101（Cr）固體。

1.3 固相微萃取濾頭的構建

取50mg MIL－101（Cr）于容量瓶中，甲醇定容至10mL，超聲使其分散均勻制成5g/L分散液，取1mL分散液注入帶有0.22 μm濾膜的針頭式尼龍過濾器，MIL－101（Cr）晶體被攔截于過濾器內，制成MIL－101（Cr）固相微萃取濾頭。

模擬固相萃取過程，利用注射泵將10mL超純水以2.5 mL/min速度推過MIL－101（Cr）固相微萃取濾頭，注射器移取1mL甲醇推過該濾頭，收集甲醇洗脫液。通過測量MIL－101（Cr）的紫外吸收光譜與水合粒徑得到MIL－101（Cr）的特征峰，再通過測量濾液及洗脫液的紫外吸收光譜與其中顆粒的水合粒徑，對MIL－101（Cr）固相微萃取濾頭中尼龍濾膜的完整性進行表征。

1.4 萃取過程

SPME－FSF裝置與萃取過程如圖1所示。吸附：以注射器吸取10mL樣品溶液，并以2.5 mL/min流速推過MIL－101（Cr）固相微萃取濾頭；洗滌：以注射器吸取2mL10%（體積分數）甲醇/水推過萃取頭；洗脫：吸取1mL甲醇推過萃取頭，洗脫液以HPLC－FLD分析。

圖1 填充針頭式過濾器固相微萃取示意圖Fig.1 Schematic illustration for SPME－FSF

分散固相萃取（DSPE）過程如下：吸附：取10mL樣品溶液加至15mL離心管中，加入5mg MIL－101（Cr），超聲10min；洗滌：10000r/min離心15min后棄上清液，以2mL10%甲醇/水超聲10min；洗脫：離心棄上清液，沉淀以1mL甲醇超聲10min，過0.22 μm濾膜，濾液待HPLC－FLD分析。

1.5 液相色譜檢測條件

使用配備C18X Bridge柱（250mm×4.6 mm，5μm）和2475FLR檢測器的e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）進行HPLC－FLD分析。流動相：乙腈（A）和2%（體積分數）乙酸/水（B），梯度洗脫：0～7min，50% A；7～7.5 min，50%～100%A；7.5 ～10.5 min，100% A；10.5 ～11min，100%～50%A；11～12min，50%A。進樣量為10μL，流速為1.0 mL/min，柱溫保持在25℃；激發波長為280nm，發射波長為310nm。

2 結果與討論

2.1 MIL－101（Cr）的表征

通過X射線衍射（XRD）、掃描電子顯微鏡（SEM）、BET比表面積測試對MIL－101（Cr）進行表征（圖2）。MIL－101（Cr）的XRD譜圖（圖2A）中所有衍射峰的位置和相對強度均與標準譜圖一致；SEM圖像（圖2B）顯示MIL－101（Cr）晶體為八面體形，粒徑在1μm左右，與Lebedev等［9］報道的MIL－101（Cr）晶體和SEM圖像一致，表明MIL－101（Cr）成功合成。

N2吸附－脫附等溫線和孔徑分布圖（圖2C、D）顯示MIL－101（Cr）的比表面積為3366.20 cm2/g，孔體積為1.48 cm3/g。根據3D模擬軟件已知3種雌激素的分子直徑分別為11.0 ?、10.5 ?、12.2 ?（圖2E），而MIL－101（Cr）呈介孔與微孔分布（圖2D），孔徑集中在11.4 ?、17.5 ?和30.9 ?，因此雌激素恰能進入MIL－101（Cr）內部。綜上，MIL－101（Cr）超大的比表面積與孔體積以及合適的孔徑大小非常有利于雌激素的萃取。

圖2 MIL－101（Cr）的XRD譜圖與模擬譜圖對比（A）、SEM圖像（B）、氮氣吸附－脫附等溫線（C）、孔徑分布圖（D），以及E2、E3、E1的分子結構（E）Fig.2 XRD pattern compared with simulated pattern（A），SEM image（B），nitrogen adsorption－desorption isotherms（C）and pore size distribution（D）of the as-synthesized MIL－101（Cr），and structures of E2，E3and E1（E）

2.2 固相微萃取濾頭的構建

實驗結果顯示，將MIL－101（Cr）分散液填充入過濾器后，濾液與洗脫液澄清，說明大部分MIL－101（Cr）被截留在濾膜上且濾膜無破損。為進一步探究濾液及洗脫液中是否有MIL－101（Cr）滲出以驗證濾膜完整性，對溶液紫外吸收光譜（圖3A）與顆粒水合粒徑（圖3B）進行表征。如圖所示，MIL－101（Cr）在307nm處有最大吸收峰，平均水合粒徑為981nm，過濾液中檢測到微量水合粒徑為100～300nm的顆粒，可能是超聲分散過程中有極少量的MIL－101（Cr）晶體破碎或溶解變小，得以通過0.22 μm孔徑濾膜；洗脫液無大于10nm的顆粒存在，表明固相微萃取濾頭中濾膜在2.5 mL/min流速和對應的壓力下進行萃取后仍能保證完整，這有利于后續萃取過程中固相與液相的分離，實現對色譜柱的保護作用。

圖3 MIL－101（Cr）的紫外吸收光譜圖（A）及水合粒徑圖（B）Fig.3 UV absorption spectra（A）and hydrodynamic size（B）of MIL－101（Cr）a：MIL－101（Cr）dispersion；b：MIL－101（Cr）filtrate；c：eluent after SPME

通過研究DSPE與SPME－FSF方法對雌激素的萃取率證明該方法的有效性（圖4A）。結果表明，與傳統DSPE相比，自制固相微萃取裝置的萃取效率提高了3～12倍。為進一步探究其萃取回收率顯著提高的原因，分別采用空白Nylon過濾器、MIL－101（Cr）粉末以及填充有MIL－101（Cr）的Nylon過濾器、PTFE過濾器對3種雌激素進行萃取（圖4B）。以E2為例，MIL－101（Cr）的DSPE回收率不足20%；PTFE濾膜對雌激素無明顯吸附作用（數據未給出），但將吸附劑填充至PTFE過濾器后，E2回收率提高至60%，這可能是因為將吸附劑固定于過濾器內，易于固液相分離，減少了由于離心轉移造成的樣品與吸附劑損失。Nylon濾膜對E2有吸附作用，回收率約50%，與文獻結果一致；基于填充有MIL－101（Cr）的Nylon過濾器SPME－FSF使回收率增加至約90%［10］。可見：SPME－FSF能通過減少操作損失提高回收率，而對分析物具有吸附作用的Nylon濾膜發揮了顯著的協同增效作用。

圖4 基于MIL－101（Cr）的DSPE和SPME－FSF方法對分析物的萃取效果（A）；Nylon過濾器、MIL－101（Cr）以及填充有MIL－101（Cr）的Nylon過濾器、PTFE過濾器對分析物的萃取效果（B）Fig.4 Extraction effect of DSPE and SPME－FSF on analytes based MIL－101（Cr）（A）；extraction effect of nylon filter，MIL－101（Cr），nylon filter and PTFE filter filled with MIL－101（Cr）on analytes（B）

2.3 萃取條件的優化

考察了洗脫劑、淋洗液、注射速度、離子強度、溶液pH值等條件對萃取效果的影響。實驗過程使用加標的純水樣品（0.2 mg/L），固相微萃取濾頭不重復使用，所有實驗均重復3次。

2.3.1 洗脫劑為提高洗脫效率，解吸溶劑必須比吸附劑對分析物具有更高的親和力［5］。實驗選用甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等溶劑作為洗脫劑對3種目標物進行洗脫。由圖5A可見，以甲醇作洗脫劑時，3種分析物的洗脫效果明顯優于其他溶劑，因此選擇甲醇作為洗脫劑。

2.3.2 淋洗液合適的淋洗液能在減小基質影響的同時避免造成分析物的損失。選擇不同濃度的甲醇/水、乙腈/水進行洗滌，結果表明（圖5B）甲醇/水對分析物回收率的影響較小，為更有效去除樣品中的脂溶性雜質，選取10%甲醇/水作為淋洗液。同時對淋洗液體積（1、2、3、10mL）進行了優化，發現當淋洗液體積為2mL時分析物的回收率最高。這可能是因為適當體積的淋洗液能在洗滌過程中去除干擾物，有利于后續的分析物洗脫，而當淋洗液體積過大時，部分分析物被淋洗液洗脫，導致回收率降低。因此，實驗選擇2mL10%甲醇/水作為淋洗液。

2.3.3 注射速度萃取過程中樣品溶液通過濾頭的速度影響分析物與吸附劑的接觸時間，進而影響萃取效果。結果顯示，流速小于2.5 mL/min時，3種分析物的回收率無顯著差異，當注射流速大于2.5 mL/min時，因萃取時間縮短導致回收率下降。基于省時高效的目的，實驗選擇注射速度為2.5 mL/min。

2.3.4 離子強度水溶液中離子強度會影響分析物的水溶性以及辛醇－水分配系數［11］進而影響萃取效果，因此本實驗通過在萃取前向溶液中加入不同量的NaCl，考察了NaCl含量為0、5%、10%、15%、20%和30%對萃取過程的影響（圖5C）。結果表明，隨著鹽含量的增加，E3的回收率變化不大，但E2、E1的回收率顯著降低，這可能是因為隨著鹽含量的增加，溶液粘度增加導致傳質效率降低，且極性雌激素分子與鹽分子發生了靜電相互作用，導致分析物的回收率降低［12］。所以實驗選擇樣品中不加鹽，這也簡化了萃取過程。

2.3.5 樣品溶液pH值樣品溶液的pH值決定了分析物的存在形式，因此是影響萃取效率的最重要因素之一。通過添加HCl或NaOH溶液調節樣品pH值，考察了樣品溶液pH值對3種分析物回收率的影響（圖5D），結果顯示，pH＞6.0 時，分析物的回收率隨pH升高而逐漸降低。這是因為在適當的酸性條件下，雌激素為游離分子態，疏水作用、π－π相互作用、氫鍵相互作用等作用力的存在更有利于吸附；而在堿性條件下，分析物離子化導致回收率下降［13］。因此實驗選擇樣品pH值為6.0 。

圖5 洗脫劑（A）、淋洗液種類（B）、鹽離子濃度（C）以及樣品溶液pH值（D）對分析物回收率的影響Fig.5 Effect of elution solvent（A），washing solvent（B），salt concentration（C）and sample pH（D）on the extraction recoveries for analytes

2.4 方法驗證

在最佳萃取條件下，配制一系列質量濃度的雌激素標準溶液，采用本方法進行分析，并以目標物的質量濃度（x，μg/L）為橫坐標，以峰面積（y）為縱坐標作圖，得到3種雌激素的標準曲線。結果表明，E2、E3的線性范圍為0.2 ～500μg/L，檢出限（S/N=3）分別為0.05 、0.06 μg/L，定量下限（S/N=10）分別為0.16 、0.20 μg/L；E1因熒光信號弱導致檢出限較高（1.50 μg/L），線性范圍為5～500μg/L；3種雌激素的相關系數（r2）為0.9982 ～0.9993 （見表1）。使用相同方法制備的固相微萃取濾頭對3種雌激素進行分析，以日內（n=6）、日間（n=3）的相對標準偏差（RSD）對不同濾頭間的精密度進行驗證，日內和日間RSD為0.20 %～6.1 %，證明該方法具有良好精密度。

表1 本方法的線性關系、檢出限、定量下限及相對標準偏差Table1 Linear relations，detection limits，quantitation limits and RSDs of the proposed method

2.5 方法對比

表2對本方法與文獻報道的其他固相萃取方法進行了比較，結果顯示，本方法具有萃取裝置簡單、成本低、吸附劑用量少（5mg）、耗時短（萃取時間4min）、靈敏度高等優點。

表2 本方法與文獻報道測定方法的比較Table2 Comparison of the proposed method with reported methods for the analysis of E2，E3and E1

2.6 實際樣品的檢測

在最優條件下，將本方法應用于自來水、飲用水和湖水樣品中3種雌激素的檢測，3種樣品中均未檢出目標物。圖6為實際湖水樣品、加標湖水樣品與雌激素標準溶液的色譜圖。為驗證本方法在實際樣品分析中的準確性，對上述3種實際樣品進行加標回收實驗，所有分析物的回收率為84.1%～108%，RSD不大于5.5%（見表3）。

圖6 實際湖水樣品（a）、加標湖水樣品（b）與標準溶液（c）的色譜圖Fig.6 Chromatograms of lake water sample（a），spiked lake water sample（b）and the standard solution of estrogens（c）b：spiked10μg/L for E3and E2，100μg/L for E1；c：10μg/L for E3and E2，100μg/L for E1

表3 實際樣品中E2、E3、E1的檢測值及加標回收率（n=3）Table3 Analytical results and recoveries of estrogens in real samples（n=3）

3 結 論

本文通過水熱合成法成功制備了MIL－101（Cr）并將其填入針頭式尼龍過濾器，構建了一種簡單、高效、低成本的固相微萃取裝置，結合HPLC－FLD建立了水樣中3種雌激素的檢測方法。開發的固相微萃取裝置具有操作簡單、吸附劑用量少、成本低、耗時短等優點，所建立的分析方法線性范圍寬、靈敏度較高，回收率和精密度較好，適用于水樣中雌激素的篩查與確證。