一種基于1，4-親核加成反應的新型熒光探針及其在食品和活細胞中的應用

張春香，唐斯萍，李雯倩，申有名，谷 標*

（1.湖南文理學院 化學與材料工程學院，湖南 常德 415000；2.衡陽師范學院 化學與材料科學學院，功能金屬有機化合物湖南省高校重點實驗室，湖南 衡陽 421008）

亞硫酸鹽（SO2?3）是一種強還原劑，廣泛用作食品添加劑，可防止食品氧化和維持食物顏色光鮮亮麗［1］。此外，一定量的亞硫酸鹽會阻礙微生物正常的生理氧化過程并抑制微生物的增殖［2］。因此，亞硫酸鹽在農副產品加工中常被用作防腐劑和漂白劑。研究表明，攝入過量的亞硫酸鹽會導致呼吸系統疾病、心血管疾病、肺癌及多種神經性疾病［3］。鑒于亞硫酸鹽的有害影響，世界衛生組織建議人體攝入亞硫酸鹽水平應低于0.7 mg/kg［4］。因此，發展可靠、有效的方法來檢測食品和生物體內亞硫酸鹽具有重要意義。

目前已有的亞硫酸鹽檢測方法包括流動注射法［5］、電化學法［6］、毛細管電泳分析［7］和其他方法［8－9］。然而，這些方法存在操作復雜、儀器昂貴、侵入性或破壞性檢測等問題，很難用于生物體內亞硫酸鹽的檢測。相比之下，熒光探針，特別是具有比色和熒光雙重響應的探針，由于觀察方便、樣品預處理簡單、適用于實時監測和生物成像分析等優點，被視為分析物檢測的有力工具［10－11］。迄今為止，已經報道了許多亞硫酸鹽熒光探針［12－15］。根據反應機理，主要分為基于氫鍵形成［16］、乙酰丙酸酯的選擇性去保護［17］和親核加成反應［18］的亞硫酸鹽熒光探針3類。盡管報道的熒光探針在亞硫酸鹽檢測和成像方面取得了一定成就，但仍存在一些問題。例如，基于氫鍵形成機理的亞硫酸鹽探針容易受到溶劑與亞硫酸鹽之間氫鍵的干擾，在檢測中的選擇性和靈敏性不盡人意［19－20］。基于乙酰丙酸酯去保護反應機理的探針被報道能與水合肼反應［21］，產生相同的熒光響應，對亞硫酸鹽檢測存在潛在干擾。此外，一些探針檢測時間長、水溶性差，難以滿足實時檢測及生物成像要求［22］。因此，開發快速響應、靈敏性和選擇性高、適于亞硫酸鹽檢測和成像的熒光探針尤為重要。

本研究設計并合成了一種新型亞硫酸鹽熒光探針CQ（見圖1）。探針CQ通過乙烯橋鍵將N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽片段與4-氰基苯乙腈片段連接。其中，N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽片段不僅能與亞硫酸鹽發生1，4-親核加成反應，作為亞硫酸鹽的特異性識別位點，還能提高整個探針分子的水溶性。在與亞硫酸鹽作用前，探針CQ內具有拉電子性質的N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽與4-氰基苯乙腈片段形成“拉－拉”電子體系，分子內電子轉移過程（ICT）受阻，熒光較弱。與亞硫酸鹽作用后，N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽片段由拉電子性質變為推電子性質，在探針CQ內形成“推－拉”電子體系，ICT過程開啟，熒光恢復。結果表明探針CQ對亞硫酸鹽識別具有比色和熒光雙重響應、反應迅速、靈敏性和選擇性高的特點。更重要的是，該探針不僅可用于食品中亞硫酸鹽的定量分析，還可用于HeLa細胞內亞硫酸鹽的可視化成像，有望在食品監測及生物傳感領域得到廣泛應用。

圖1 探針CQ合成路徑圖Fig.1 Synthesis route of probe CQ

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

Bruker AVANCE－400MHz型核磁共振波譜儀（甲基硅烷（TMS）為內標），UV－2600型紫外可見分光光度計、RF－5301PC型熒光分光光度計（Shimazu Co，Japan），FluoView FV1200MPE奧林巴斯激光掃描共聚焦顯微鏡。

4-氰基苯乙腈、3-喹啉甲醛、三氟甲基磺酸甲酯和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）購于安耐吉化學有限公司。其他分析純試劑購于國藥集團化學試劑（上海）有限公司。

1.2 探針CQ的合成

化合物1的合成與表征：將4-氰基苯乙腈（284.3 mg，2.0 mmol）和3-喹啉甲醛（314.3 mg，2.0 mmol）置于一潔凈的圓底燒瓶（50mL）中，向其中加入哌啶（100μL）和乙醇（20mL），隨后將圓底燒瓶于50℃油浴鍋中攪拌反應12h。待反應結束后，有白色固體析出。反應混合液經過濾、水洗后，得到純凈的化合物1（517.6 mg，92%）。1H NMR（400MHz，DMSO－D6）：δ9.33 （d，J=2.1 Hz，1H），8.96 （d，J=1.5 Hz，1H），8.51 （s，1H），8.11 （t，J=7.7 Hz，2H），8.08－8.00 （m，4H），7.91 （dd，J=11.7 ，4.5 Hz，1H），7.73 （t，J=7.5 Hz，1H）；13C NMR（101MHz，DMSO?D6）：δ151.19 ，148.33 ，143.19 ，138.28 ，136.76 ，133.69 ，132.10 ，129.58 ，129.33 ，128.27 ，127.35 ，127.21 ，118.87 ，117.62 ，112.29 ，111.55 。

探針CQ的合成與表征：將化合物1（281.3 mg，1.0 mmol）和三氟甲基磺酸甲酯（197.0 mg，1.2 mmol）溶解于10mL三氯甲烷中，將混合物室溫下攪拌反應12h。待反應結束后，有淡黃色沉淀物質生成。經過濾、干燥，得到純凈的探針CQ（368.2 mg，83%）。1H NMR（400MHz，DMSO－D6）：δ9.87 （s，1H），9.75 （s，1H），8.61－8.59 （d，J=8.4 ，2H），8.54 （s，1H），8.41－8.37 （m，1H），8.17－8.11 （m，3H），8.06－8.04 （d，J=8.4 ，2H），4.71 （s，3H）；13C NMR（101MHz，DMSOD6）：δ151.35 ，145.45 ，139.44 ，138.56 ，137.30 ，137.19 ，133.95 ，131.62 ，131.33 ，129.09 ，128.07 ，127.47 ，119.99 ，116.53 ，115.57 ，113.20 ，46.50 。

1.3 光譜測試

以色譜純DMF為溶劑，配制濃度為1mmol/L的探針CQ儲備液。以去離子水為溶劑，分別配制濃度為1mmol/L的Na2SO3儲備液和10mmol/L其他干擾物質（Zn2+、Cu2+、K+、Fe3+、Al3+、I－、F－、AcO－、Cl－、N、NO2－、H2PO4－、C－、ClO3－、S2－、SCN－、S－、Hcy、Cys、GSH、N2H4、H2O2、ClO?、S）溶液。樣品溶液的配制：取若干個2mL的測試管，依次加入20μL CQ儲備液（1mmol/L）、180μL DMF和Na2SO3或者其他干擾物質儲備液，用PBS溶液（20mmol/L，pH7.4）定容，放置2min后進行光譜測試。

1.4 食品中亞硫酸鹽的檢測

用于實際樣品分析的白砂糖、石冰糖和紅酒購于附近超市。糖類樣品溶液配制：準確稱取2.5 g白砂糖和石冰糖，分別用去離子水溶解，定容至10.00 mL。紅酒樣品溶液配制：準確移取1mL紅酒，用去離子水稀釋，定容至100.00 mL。樣品測試方法：用移液槍準確移取一定體積的樣品溶液放置在2mL的測試管中，再依次加入20μL CQ儲備液（1mmol/L）和180μL DMF，最后用PBS溶液（20mmol/L，pH 7.4）稀釋至刻度。待樣品溶液孵育2min后，轉移至比色皿（1cm）中，通過熒光光譜儀測試其發射光譜并記錄511nm處的熒光強度。回收率實驗：向樣品溶液中添加不同且已知濃度的Na2SO3標準液（1.0 μmol/L或2.0 μmol/L），利用探針CQ測定加標后樣品中亞硫酸鹽的總含量及回收率。

1.5 細胞成像

取對數生長期的HeLa細胞（人宮頸癌細胞），稀釋成2.0 ×104cell/mL的細胞懸液，接種于培養皿中，使之生長24h。待細胞貼壁生長后，移除培養基，用溫熱（37℃）的PBS緩沖液沖洗3次。在細胞成像之前，首先取一部分HeLa細胞，放置在含有探針CQ（10μmol/L）的DMEM培養液（10%小牛胚胎血清的杜爾貝科改良伊格爾培養基）中，使之在37℃，5%CO2的培養箱中生長30min。用溫熱的PBS緩沖液沖洗細胞外殘留的探針CQ，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍攝細胞的明場和熒光圖。另取一部分HeLa細胞與探針CQ（10μmol/L）共孵育30min后，繼續與Na2SO3（10μmol/L）共孵育5min。經PBS緩沖液沖洗后進行細胞成像。

2 結果與討論

2.1 光譜表征

在合成探針CQ后，通過紫外－可見吸收光譜儀和熒光光譜儀測試其在PBS溶液（DMF∶H2O=1∶9，體積比，pH7.4）中對亞硫酸鹽的識別性能。如圖2所示，探針CQ在335nm處有一個紫外吸收峰。加入亞硫酸鹽后，335nm處的吸收峰消失，同時在442nm處產生一個強的紫外吸收峰，表明探針CQ與亞硫酸鹽發生化學反應生成了一種新的物質。向探針CQ溶液中加入亞硫酸鹽后，溶液顏色由無色變成黃色。以最大吸收波長335nm為激發波長測得探針CQ的熒光發射波長為447nm。采用442nm的激發波長測定探針CQ的熒光光譜時，其熒光強度較弱，發射光譜幾乎呈一條直線；加入亞硫酸鹽后，探針CQ在511nm處出現一個明顯的發射峰，其熒光強度增加35倍。上述實驗結果表明，探針CQ可作為一種亞硫酸鹽的比色/熒光傳感器。

2.2 反應機理

基于探針CQ與亞硫酸鹽作用前后的紫外及熒光光譜變化，推測探針CQ中的N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽與亞硫酸鹽發生親核加成反應，使光譜發生相應變化。為證實這一猜測，借助核磁共振儀對探針CQ與亞硫酸鹽反應前后的氫譜進行監測。實驗結果如圖3所示，與亞硫酸鹽反應后，探針CQ中N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽上的芳氫（N原子對位的氫）和甲基氫分別向高場移動（芳氫從9.67 移動到5.58 ，甲基氫從4.65 移動到3.36 ），表明亞硫酸鹽與N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽發生1，4-邁克爾加成反應。因此，提出如下識別機理（圖4）：具有親核性的亞硫酸鹽通過1，4-邁克爾加成反應攻擊探針CQ上的N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽片段，生成熒光產物CQ－SO32－。在探針CQ與亞硫酸反應后，具有拉電子性質的N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽轉變成推電子性質的片段，與具有拉電子性質的4-氰基苯乙腈片段形成“推－拉”電子結構，使分子內ICT過程開啟，最終導致紫外和熒光增強，溶液由無色變成黃色。

2.3 條件優化

為了準確檢測亞硫酸鹽，對檢測條件（包括pH值和反應時間）進行了優化。圖5A展示了探針CQ在不同pH值條件下對亞硫酸鹽的熒光響應情況。可以看到探針在整個pH值范圍內熒光微弱，熒光強度變化很小，表明探針具有較好的穩定性。然而，在加入亞硫酸鹽后，探針溶液在pH6.0 ～10.0 范圍內有明顯的熒光增強。考慮到后續生物成像應用，選擇測試溶液的pH值為7.4。反應時間對亞硫酸鹽檢測的影響如圖5B所示，可以看到探針與亞硫酸鹽混合后，熒光強度迅速增加，并在20s內達到平衡。如此快的反應速度使探針能夠實時監測亞硫酸鹽。

2.4 靈敏性及選擇性

在PBS溶液（DMF∶H2O=1∶9，體積比，pH7.4）中，控制探針CQ濃度為10μmol/L，通過改變SO32－的濃度（0～10μmol/L），測定體系熒光光譜的變化情況。發現在探針CQ溶液中加入SO32－后，體系在511nm處的熒光強度（Y）與SO32－的濃度（X，0～10μmol/L）呈現良好的線性關系，線性方程為Y=74.1148 X+21.7276 ，R2=0.9972 。根據檢出限（DL）計算公式（DL=3σ/k，σ為空白樣品連續測定11次后的標準偏差，k為標準曲線斜率）［23］，得到探針CQ對亞硫酸鹽的檢出限為25nmol/L。

為了考察探針CQ的選擇性，測試了其在不同分析物存在下的熒光光譜。選定的干擾物主要包括一些常見的與環境和生物相關的離子（Zn2+、Cu2+、K+、Fe3+、Al3+、I－、F－、AcO－、Cl－、NO3－、NO2－、H2PO4－、CO32－、ClO3－、S2－、SCN－、SO42－）、水合肼（N2H4）、含巰基的氨基酸（Hcy、Cys、GSH）以及氧化物種（H2O2、ClO－）。由圖6可見，向探針CQ溶液中加入亞硫酸鹽后，511nm處的熒光強度明顯增加，而加入其他分析物質后，熒光強度幾乎無變化，表明探針CQ對亞硫酸鹽具有較好的選擇性，可用于亞硫酸鹽的定性和定量分析。

2.5 實際樣品分析

鑒于探針CQ優異的識別性能，進一步考察了其檢測實際樣品中亞硫酸鹽的可行性。3種食物樣品白砂糖、石冰糖和紅酒購于附近超市，經預處理之后，采用標準回收率方法測試樣品溶液中的亞硫酸鹽含量，即：先向樣品溶液中加入不同且已知濃度的Na2SO3標準液（1.0 μmol/L或2.0 μmol/L），測定其熒光光譜，將測得的熒光強度（I511nm）代入標準曲線方程計算亞硫酸鹽含量。分析結果如表1所示，Na2SO3的加標回收率為96.7%～105%，表明探針CQ可用于食品中亞硫酸鹽的定量分析，具有良好的實用價值。此外，分別用探針CQ和常規滴定法測試了樣品溶液中亞硫酸鹽的含量。由于紅酒自身的顏色干擾滴定終點的判斷，所以本實驗選擇襯度高的糖樣品溶液進行滴定實驗。結果如表2所示，可以看到本方法測得的亞硫酸鹽的濃度與常規滴定法的測定結果基本一致，表明本方法具有較高的準確性。

表1 食品樣品中Na2SO3的測定Table1 Detection results of Na2SO3in food samples

表2 不同方法測定食品中Na2SO3濃度的結果Table2 Results for Na2SO3in food samples detected by the probe CQ and direct iodometric method

2.6 細胞成像

為了探究探針CQ在生物體內的潛在應用能力，進行了細胞熒光成像實驗。結果如圖7所示，當HeLa細胞與探針CQ（10μmol/L）于37℃下共孵育30min后，在熒光顯微鏡下觀察不到任何熒光信號（圖7A下圖）。然而，當HeLa細胞與探針CQ（10μmol/L）共孵育30min，再與Na2SO3（10μmol/L）共孵育5min后，可以觀察到細胞內部有明顯的綠色熒光（圖7B下圖）。說明探針CQ與細胞內的Na2SO3發生了1，4-邁克爾加成反應，釋放熒光信號。通過明場圖（圖7A和7B上圖），可以看到細胞結構完整，狀態正常，表明探針CQ具有較好的生物相容性。上述實驗表明探針CQ可用于活細胞內亞硫酸鹽的可視化成像。

2.7 與已有探針的比較

將當前探針與其他HSO3－/SO32－熒光探針進行比較。從表3可知，探針CQ對亞硫酸鹽檢測具有反應迅速、水溶性好、靈敏性和選擇性高的特點。這主要是因為本研究構建的探針是以N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽為亞硫酸鹽的特異性識別位點，不僅能賦予探針較高的選擇性和靈敏性，還能提高整個探針分子的水溶性。

表3 CQ與其他HSO3－/SO32－熒光探針的比較Table3 The comparison of CQ with other fluorescence probes for HSO3－/SO32－

3 結 論

本文基于1，4-邁克爾加成反應機理，研制了一種兼具比色和熒光響應的亞硫酸鹽探針CQ。該探針對亞硫酸鹽具有響應快、靈敏性和選擇性高的特點。在實際應用方面，探針CQ不僅可用于食品中亞硫酸鹽的定量分析，還可用于活細胞內亞硫酸鹽的熒光成像。因此，本研究為食品樣品和生命系統中亞硫酸鹽的檢測提供了一種有效、方便的工具。