槍頭式羧基化多壁碳納米管固相萃取/高效液相色譜測定飲用水中雙酚類化合物

朱培杰，涂雪元，周家歡，陳奕全，劉艷清，汪洪武

（肇慶學院 食品與制藥工程學院，廣東 肇慶 526061）

雙酚類化合物（Bisphenols，BPs）是一類重要的有機化工原料，被廣泛用于塑料瓶、食品接觸涂層、化妝品、藥物等各類工業和消費產品中［1－2］。這些產品與人類的日常生活密切相關，近年來世界各地的飲用水中均檢出了該類物質［3－4］。大量研究表明，雙酚類物質是潛在的內分泌干擾物，與多種人類疾病顯著相關，如生殖毒性、甲狀腺功能障礙、器官損傷、肥胖促進作用等［5－7］。因此，建立快速、準確、靈敏、高效的分析方法對于飲用水中雙酚類物質的監測尤為重要。

雙酚類物質在飲用水中的殘留濃度低，且水體有一定的干擾物，因此需對樣品進行前處理。目前，常用的樣品前處理技術主要包括液液萃取［8］、分散液液微萃取［9］、免疫親和柱凈化［10］、分子印跡技術［11］和固相萃取（SPE）［12］等。其中，SPE技術可同時完成樣品的富集和凈化，操作簡便，已被廣泛用于水樣中雙酚類化合物的前處理［13－14］。固相萃取吸附劑是影響SPE柱富集和凈化效果的關鍵因素，常用的吸附劑包括活性炭、鍵合硅膠、分子印跡吸附劑和納米材料等［15］。通常，SPE柱中需加入20～30mg的固相萃取吸附劑，才能對樣品中的分析物進行充分吸附。由于固相萃取吸附劑價格昂貴，在一定程度上增加了實驗成本。

多壁碳納米管（MWCNTs）作為一種磁性材料，具有離域大π電子系，可通過非共價作用富集芳香類化合物，不受氫鍵和pH值干擾，是一種理想的固相萃取吸附劑。此外，MWCNTs還具有超高的比表面積，幾毫克的用量即可滿足實際樣品中待測物的富集需求，可降低實驗成本。Guo等［16］以3mg MWCNTs為固相萃取吸附劑，結合氣相色譜－質譜（GC－MS）檢測技術，實現了對環境水樣中16種多環芳烴的定量檢測。Springer等［17］采用6mg MWCNTs為固相萃取吸附劑，結合毛細管電泳（CE），開發了水樣中氯磺隆和甲基甲磺隆的快速定量方法。本文以羧基功能化的MWCNTs為填料，制備新型的槍頭式固相萃取（PT－SPE）小柱，結合高效液相色譜建立了飲用水中5種雙酚類化合物的分離分析方法，并用于實際樣品的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-2030高效液相色譜儀（日本島津公司），KX1613T型超聲清洗器（北京科璽世紀科技有限公司），TL80-1型高速離心機（江蘇天力醫療器械有限公司），ATY124分析天平（日本島津公司），1mL移液槍（大龍興創實驗儀器有限公司）。

雙酚類化合物標準品：雙酚A（BPA）、雙酚E（BPE）、雙酚F（BPF）、雙酚Z（BPZ）、四甲基雙酚A（TMBPA）（純度≥98%，百靈威科技有限公司），甲醇（MeOH）、乙醇（EtOH）、乙腈（ACN）（色譜純，上海安譜科學儀器有限公司），氨基化多壁碳納米管（NH2－MWCNTs）、羧基化多壁碳納米管（COOH－MWCNTs）、羥基化多壁碳納米管（OH－MWCNTs）（純度≥95%，長度8～15nm，南京先豐納米材料科技有限公司）。

1.2 實驗過程

1.2.1 標準溶液的配制分別準確稱取BPA、BPE、BPF、BPZ、TMBPA的標準物質各10mg，用甲醇溶解并定容至100mL，配成100mg/L的單標儲備液，于4℃冰箱保存。

1.2.2 樣品前處理 準確稱取1.5 mg多壁碳納米管，裝填在兩端塞有棉花的1mL移液槍槍頭中，制成簡易PT－SPE小柱，依次經3mL甲醇和3mL純水活化平衡，備用。取5mL水樣，調節其pH值為5，經PT－SPE小柱富集后，用3mL純水沖洗殘留在柱上的離子及強極性干擾物質，減少對目標化合物檢測的影響，然后用0.5 mL甲醇洗脫目標化合物，待HPLC分析（圖1）。

圖1 PT－SPE小柱的操作流程圖Fig.1 Schematic diagram of PT－SPE cartridge

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Shim－pack GIST C18（250mm×4.6 mm，5μm）；柱溫：30℃；檢測波長：230nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：5μL；流動相：ACN（A）和H2O（B）。梯度洗脫程序：0～5.0 min，35%B；5.0 ～10.0 min，35%～5%B；10.0 ～11.0 min，5%～35%B；11.0 ～15.0 min，35%B。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的優化

考察了質量濃度為20mg/L的BPF、BPE、BPA、BPZ和TMBPA混合標樣在不同流動相下的分離情況。結果表明，采用ACN－H2O（75∶25，體積比）為流動相進行等度洗脫時，由于流動相的洗脫能力太強，BPE和BPA未能實現基線分離。當采用ACN－H2O（65∶35）作為流動相時，所有化合物均能實現基線分離，但分析時間大于20min。為提高方法準確性和實驗效率，確定采用“1.3 ”所示的梯度洗脫方式對雙酚類化合物進行分離。5種雙酚類化合物在13min內均實現了基線分離，峰形良好，無拖尾現象（圖2）。

圖2 5種雙酚類化合物的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of five bisphenol compounds

2.2 固相萃取條件的優化

2.2.1 多壁碳納米管種類的選擇雙酚類化合物在飲用水中的含量非常低，一般需經過富集才能被液相色譜儀檢測。本文選取3種功能化的多壁碳納米管（羧基化、氨基化和羥基化），按照“1.2.2 ”步驟制備PT－SPE小柱，5種雙酚類化合物的添加水平均為110μg/L，上樣量為5mL，考察多壁碳納米管的種類對雙酚類化合物富集效果的影響。結果表明，氨基化、羥基化、羧基化多壁碳納米管的富集效率分別為14.8 %～64.7 %、53.9 %～80.0 %和73.9 %～95.8 %。羧基化多壁碳納米管的富集效果明顯較優，這可能與羧基化多壁碳納米管與雙酚類化合物之間有較強的π－π作用有關。因此，后續實驗選擇羧基化多壁碳納米管作為富集材料。

2.2.2 羧基化多壁碳納米管用量的選擇羧基化多壁碳納米管的用量會影響PT－SPE小柱對雙酚類物質的吸附效率。其他實驗條件保持不變，向1mL槍頭中分別加入不同質量（0.5 ～2.0 mg）的羧基化多壁碳納米管，考察5種雙酚類化合物的回收率（圖3）。結果顯示，5種雙酚類化合物的回收率隨著羧基化多壁碳納米管用量的增大呈先增加后降低的趨勢，當其用量為1.5 mg時，5種化合物的回收率最高（76.4 %～99.6 %）。因此，選擇羧基化多壁碳納米管的用量為1.5 mg。

圖3 羧基化多壁碳納米管的用量對5種雙酚類化合物回收率的影響Fig.3 Effect of amounts of COOH－MWCNTs on the recoveries of five bisphenol compounds

2.2.3 樣品pH值的選擇樣品的pH值不僅影響雙酚類化合物在色譜柱上的保留時間，也會影響多壁碳納米管對雙酚類化合物的吸附。選取甲酸和氨水調節水樣的pH值，考察了pH值對樣品回收率的影響（圖4）。結果表明，pH值為3～5時，5種雙酚類化合物的回收率隨著pH值的升高而增加，在pH5時回收率達到最大。當pH值繼續升高（pH5～7）時，回收率呈下降趨勢。因此選擇最佳pH值為5。

圖4 不同pH值對雙酚類化合物回收率的影響Fig.4 Effect of pH values on the recoveries of bisphe?nol compounds

2.2.4 洗脫劑種類的選擇洗脫劑的種類也是固相萃取中影響回收率和富集倍數的重要因素之一。本文選擇MeOH、EtOH、ACN、MeOH/H2O（50∶50，體積比）4種溶劑作為洗脫劑，考察其對雙酚類化合物的洗脫效果。結果顯示，當MeOH、EtOH、ACN、MeOH/H2O（50∶50）作為洗脫劑時，5種雙酚類化合物的回收率分別為59.8 %～112%、20.1 %～77.9 %、8.6 %～32.8 %和67.9 %～102%。而4種溶劑的洗脫能力順序為：MeOH＞MeOH/H2O（50∶50）＞EtOH＞ACN。與其他溶劑相比，甲醇的洗脫能力更好，這可能與甲醇更易與雙酚類化合物形成分子間氫鍵有關。因此本文選擇MeOH作為洗脫劑。

2.2.5 洗脫劑用量的選擇洗脫劑用量不僅影響分析物的富集倍數，也會影響方法回收率。考察了甲醇用量（0.3 、0.5 、0.7 mL）對5種雙酚類化合物回收率的影響。結果顯示，甲醇用量為0.3 、0.5 、0.7 mL時，5種雙酚類化合物的回收率分別為19.7 %～94.2 %、59.8 %～109%和40.7 %～87.3 %。由于本方法主要依靠液體重力進行洗脫，隨著洗脫劑用量的增加，樣品前處理的時間也隨之延長。為獲得較大的富集倍數和較短的洗脫時間，最終選擇甲醇用量為0.5 mL。

2.3 競爭性吸附考察

5種雙酚類化合物的化學結構相似，均具有苯環和酚羥基等官能團，與羧基化多壁碳納米管有較強的π－π相互作用。由于羧基化多壁碳納米管的化學結合位點有限，因此5種雙酚類化合物在富集過程中可能存在一定的競爭關系。以5mL空白水樣為考察對象，加標質量濃度均為110μg/L，實現發現添加BPF、BPE、BPA、BPZ和TMBPA的混合標樣時，其平均回收率分別為101%、92.9 %、92.5 %、111%、59.8 %；而單獨添加BPF、BPE、BPA、BPZ、TMBPA標樣時，其平均回收率分別為91.9 %、98.7 %、102%、99.9 %、102%。與添加單標相比，混合標樣中TMBPA的回收率明顯降低，而其他4種化合物的回收率無明顯變化。這可能是因為TMBPA苯環上的甲基較多，空間位阻較大，影響了苯環與羧基化多壁碳納米管的π－π相互作用。與其他4種化合物相比，TMBPA的競爭性吸附能力較弱。

2.4 選擇性考察

選擇性是固相萃取抗干擾能力的重要性能。在樣品篩選中，考察了鄰苯二甲酸酯、苯酚、苯胺以及萘等化合物（質量濃度均為100μg/L），結果發現羧基化多壁碳納米管對鄰苯二甲酸酯、苯酚、苯胺無明顯的富集效果，但對萘的富集效果良好，回收率達到70%以上。這可能是因為鄰苯二甲酸酯、苯酚、苯胺等化合物只有1個苯環，與羧基化多壁碳納米管的π－π相互作用較弱，不能有效富集。而萘與雙酚類化合物均有2個苯環，π電子較多，與羧基化多壁碳納米管π－π相互作用較強，富集效果良好。上述結果表明，羧基化多壁碳納米管對含有多個苯環的化合物具有良好的選擇性。

2.5 分析方法的評價

2.5.1 線性關系、檢出限及回收率用初始流動相（65%乙腈水溶液）配制質量濃度分別為2.2 、11、22、110、220μg/L的5種雙酚類化合物標準溶液，采用本方法進行檢測，以其質量濃度作為橫坐標（x，μg/L），以峰面積作為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到線性回歸方程和相關系數（見表1）。結果顯示，5種化合物在2.2 ～220μg/L質量濃度范圍內與其峰面積呈良好的線性關系，相關系數r≥0.9985 。按照優化的樣品前處理和色譜條件進行實驗，以3倍信噪比對應的空白樣品添加濃度為方法檢出限（MDL），BPF、BPE、BPA、BPZ、TMBPA的MDL分別為0.050 、0.022 、0.005 、0.031 、0.097 μg/L。

表1 本方法的線性關系、方法檢出限、回收率及相對標準偏差Table1 Linear relations，MDLs，recoveries and RSDs of this proposed method

在空白瓶裝水樣中，分別添加BPF、BPE、BPA、BPZ、TMBPA標樣，加標水平為22、110、220μg/L，每個濃度做3次平行實驗，考察方法的回收率。結果表明，BPF、BPE、BPA、BPZ、TMBPA的平均回收率為91.1 %～110%，相對標準偏差（RSD）為0.20 %～4.3 %，說明該方法準確、穩定。

2.5.2 重現性及穩定性在相同實驗條件下，平行制備3個PT－SPE小柱，對5種雙酚類化合物加標濃度均為44μg/L的自來水樣品進行測定，其回收率的RSD為8.1 %～16%，表明此PT－SPE小柱具有良好的重現性。使用同一PT－SPE小柱對自來水樣品進行平行測定，日內（n=9）和日間（n=3）RSD分別為1.2 %～5.9 %、2.9 %～5.6 %，表明該PT－SPE小柱具有良好的穩定性。

2.6 與文獻報道方法的比較

將本方法與文獻報道的分析方法比較，結果見表2。與文獻方法相比，本方法的PT－SPE小柱制備簡單，且分析方法的檢出限較低（5～97ng/L），適用于水樣中雙酚類化合物的快速檢測。

表2 不同分析方法測定雙酚類化合物的對比Table2 Comparison of different analytical methods for BPs determination

2.7 實際樣品測定

在本地市場購買了5種不同品牌的塑料瓶裝飲用水，按照本方法進行處理和檢測。5種飲用水中均未檢出BPF、BPE、BPA、BPZ、TMBPA。結果表明，本方法簡單快捷，可以滿足飲用水中雙酚類化合物的快速定性與定量檢測要求。

3 結 論

本文以羧基化多壁碳納米管為固相萃取吸附劑，制備了新型的PT－SPE小柱，結合高效液相色譜對飲用水中5種雙酚類化合物進行快速定量檢測。通過考察碳納米管的種類和用量、樣品溶液的pH值、洗脫劑的種類和用量等對方法回收率的影響，確定了最佳實驗條件。與文獻報道的方法相比，本方法的檢出限和實驗成本較低，可滿足現行法規和飲用水中雙酚類化合物的痕量檢測需求。