固相萃取/超高效液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜法測定人參、人參葉與人參花中10種人參皂苷含量

陳樹東，胡文軍，孔祥詞，馮 銳，梁土金，崔媛媛，鐘滿霞

（1.廣東省中藥研究所，廣東 廣州 510640；2.廣東醫(yī)科大學，廣東 東莞 523808）

人參作為傳統(tǒng)名貴中藥材，具有大補元氣、補脾益肺、生津、安神益智等功效［1］。人參皂苷作為人參的主要活性成分，在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗抑郁等神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)方面具有一定的藥理作用［2－3］。人參中分離鑒定了近百種人參皂苷類化合物，根據(jù)苷元結(jié)構(gòu)的不同，可分為四環(huán)三萜類結(jié)構(gòu)的達瑪烷型的原人參二醇型皂苷（PPD）、原人參三醇型皂苷（PPT）和五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)的齊墩果烷型皂苷3種類型，其中，以原人參二醇型Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3和原人參三醇型Re、Rf、Rg1、Rg2等常見的人參皂苷為主要成分［4］。目前，人參皂苷的研究主要集中在人參根部，對于人參地上部分的報道較少，有研究表明人參葉［5－8］、人參花［9－11］均含有人參皂苷類成分，甚至作為人參種植副產(chǎn)物的人參葉、人參花中的功效成分和營養(yǎng)物質(zhì)含量更高［12］。因此，有必要對人參不同部位的人參皂苷含量進行準確定量。

人參皂苷的測定方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）［1，13－15］、液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用法［16－17］、膠束電動毛細管色譜法（MEKC）［18］等，其中，MEKC法由于儀器成本和實際應用的限制，較難普及。質(zhì)譜法檢測人參皂苷的多組分常采用四極桿和飛行時間質(zhì)譜檢測器（QTOF）［16－17］，QTOF檢測器具有高分辨率，適用于未知物質(zhì)的定性鑒別，而三重四極桿質(zhì)譜兼具靈敏度高、選擇性強的優(yōu)勢，更適用于已知物質(zhì)的定量分析；HPLC法是人參皂苷的主要檢測方法，但由于人參皂苷在紫外區(qū)的吸收較弱，如果樣品中的復雜成分未進行有效分離，在紫外吸收的臨界波長檢測人參皂苷時，基質(zhì)中含有的大量雜峰會對檢測產(chǎn)生較大干擾。本研究根據(jù)人參皂苷的化學性質(zhì)，采用Alumina－N/XAD-2SPE Cartridge復合固相萃取柱針對性地分離和凈化樣品中的人參皂苷成分，結(jié)合超高效液相色譜?三重四極桿質(zhì)譜建立了達瑪烷型人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Re、Rf、Rg1和Rg2含量的檢測方法，并對人參、人參花和人參葉中10種人參皂苷的含量和分布情況進行了初步研究，以期為進一步開發(fā)和利用人參資源，更好控制人參質(zhì)量提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；乙醇（分析純，廣州化學試劑廠）；甲酸、乙酸銨（LCMS級，上海安譜實驗科技股份有限公司）；正丁醇（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；固相萃取小柱（Alumina－N/XAD-2SPE Cartridge，1g/4g，10mL，上海安譜實驗科技股份有限公司）。對照品：人參皂苷Re（批號110754－201827，下同）、Rg1（110703－201731）、Rb1（110704－201827）、Rg3（110804－201504）購于中國食品藥品檢定研究院，人參皂苷Rb2（Z99800205）、Rb3（Y8650010）、Rc（U9330025）、Rd（R7880050）、Rf（T7810020）、Rg2（47560010）購于上海安譜實驗科技股份有限公司；人參、人參葉、人參花樣品各3批，均為市售并經(jīng)本實驗室鑒別。

TSQ Quantum Access MAX三重四極桿質(zhì)譜儀、UltiMate3000高效液相色譜儀（美國Thermo Scientific公司）；Sartorius CPA225D電子天平、BSA224S－CW電子天平（德國Sartorius公司）；5424R冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；MIX－1振蕩渦旋混合器（上海托莫斯科學儀器有限公司）；KQ－250E超聲波水浴器（昆山市超聲儀器有限公司）；實驗用水由Milli－Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備。

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜條件 Hypersil Gold C18色譜柱（100mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：A為5mmol/L乙酸銨溶液（含0.1 %甲酸），B為乙腈。梯度洗脫條件：0～4.0 min，81%A；4.0 ～6.0 min，81%～79%A；6.0 ～8.0 min，79%～72% A；8.0 ～15.0 min，72%～69% A；15.0 ～20.0 min，69%～54% A；20.0 ～20.5 min，54%～10%A；20.5 ～22.0 min，10%A；22.0 ～22.5 min，10%～81%A；流速：0.4 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：5μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源，負離子模式（ESI－）；掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM）；離子傳輸毛細管溫度：350℃；電噴霧電壓：3000V；蒸發(fā)溫度：400℃；碰撞氣體壓力：0.2 Pa；輔助氣：3.6 mL/min；鞘氣：10.5 mL/min。10種分析物的監(jiān)測離子對（Q1/Q3）、碰撞能量（CE）和管透鏡補償電壓見表1。

表1 10種目標化合物的化學結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜參數(shù)Table1 Chemical structures and MS/MS parameters of ten analytes

1.3 實驗方法

1.3.1 對照品溶液的制備 分別準確稱取各目標物標準品0.01 g，用甲醇溶解并配制成1mg/mL的標準儲備液，于－18℃保存。混合標準溶液：分別吸取一定量的標準儲備液，用甲醇稀釋，渦旋混勻，配制成質(zhì)量濃度為10μg/mL的混合標準溶液，于－18℃保存。混合標準工作液：移取適量混合標準溶液，用甲醇－水（30∶70，體積比）配制成系列混合標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 供試品溶液的制備提取：稱取過四號篩的樣品粉末0.2 g，精密加50mL水飽和的正丁醇，密塞，放置過夜，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）30min，過濾，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣用10mL水溶解，待固相萃取凈化。

凈化：分別用20mL70%乙醇和20mL水對Alumina－N/XAD-2SPE Cartridge固相萃取柱進行活化，取5.0 mL樣品提取溶液于已活化的SPE柱上樣，分別用20mL水進行淋洗，用20mL70%乙醇進行洗脫，收集洗脫液；洗脫液用甲醇－水（30∶70）定容至25.0 mL，混勻后過0.22 μm濾膜，即得；當樣品濃度超過標準曲線上限濃度時，采用倍量稀釋將濃度控制在標準曲線范圍內(nèi)，然后測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 人參皂苷的質(zhì)譜裂解過程及條件優(yōu)化

人參皂苷的相關質(zhì)譜研究表明，實驗條件對電噴霧電離質(zhì)譜的影響較大［19－20］。本文10種人參皂苷的分子結(jié)構(gòu)均以相同的皂苷苷元和不同的糖基構(gòu)成。通過對人參皂苷電離裂解產(chǎn)生的碎片進行分析發(fā)現(xiàn)，在ESI－模式下，原人參二醇型皂苷的準分子離子在碰撞裂解時，R3位置的糖基更易斷裂，人參皂苷Rb1先后失去2個葡萄糖基（－Glc）形成m/z945.5 和783.5 兩個特征離子峰（見表1）；人參皂苷Rb2、Rb3、Rc首先斷裂失去分子量相同的阿拉伯吡喃糖基（－Arap）、木糖基（－Xyl）和阿拉伯呋喃糖基（－Araf），形成m/z945.5 的特征離子峰，再進一步失去1個葡萄糖基，形成m/z783.5 的特征離子峰；人參皂苷Rd、Rg3在R3位置的糖基斷裂后，通過調(diào)節(jié)碰撞能量使R1位置的葡萄糖基進一步斷裂丟失，形成m/z621.5 和459.5 的特征離子峰。而原人參三醇型皂苷質(zhì)譜的裂解過程也呈現(xiàn)相似的規(guī)律，通過分別在R3和R2位置斷裂失去葡萄糖基和鼠李糖基（－Rha），先后形成m/z637.5 和475.5 的特征離子峰。可以看出，原人參二醇型皂苷和原人參三醇型皂苷的離子碎片呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性。

在確定一級質(zhì)譜準分子離子峰和相應的碎片離子后，由于人參皂苷裂解所需的能量不同，實驗通過對噴霧電壓、碰撞能量和管透鏡補償電壓等條件逐步進行優(yōu)化，進一步提升目標物的靈敏度。后續(xù)研究中，在缺少對照品的情況下，根據(jù)人參皂苷在質(zhì)譜中的裂解規(guī)律，可對其他人參皂苷的相對含量進行分析，也可對未知人參皂苷的結(jié)構(gòu)進行推斷和鑒定，進一步獲取人參皂苷的苷元、糖基和相對分子量等信息。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)人參皂苷分子結(jié)構(gòu)的碰撞斷裂規(guī)律，進一步對色譜條件進行優(yōu)化。首先通過對流動相的比較，發(fā)現(xiàn)以乙腈體系為流動相的洗脫能力優(yōu)于甲醇體系，且系統(tǒng)平衡時間相對更快。在質(zhì)譜條件優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，乙腈－水流動相體系中加入甲酸可提高離子化效率，增強人參皂苷的響應信號和穩(wěn)定性；另外，添加一定比例的乙酸銨可促進人參皂苷的離子化過程，穩(wěn)定流動相的pH值，改善部分目標物質(zhì)的峰形和提高洗脫能力；但噪音值同步增大，最終確定乙酸銨的最佳濃度為5mmol/L。最后，通過調(diào)節(jié)梯度洗脫程序使互為同分異構(gòu)體的人參皂苷進一步分離，由目標物的結(jié)構(gòu)可知，原人參二醇型皂苷Rc、Rb2和Rb3與原人參三醇型皂苷Rg1和Rf分別為兩組同分異構(gòu)體，雖然檢測離子碎片相同，但可通過保留時間的不同得到分離（見圖1）；而另一組保留時間接近的人參皂苷Rg3和Rg2同分異構(gòu)體，由于皂苷結(jié)構(gòu)的不同，也能通過離子碎片的不同加以區(qū)分。在優(yōu)化的色譜條件下，10種待測物質(zhì)均得到有效分離，從而實現(xiàn)準確定量的目的。

圖1 10種人參皂苷的定量離子圖譜Fig.1 Quantitative ion chromatograms of ten ginsenosides

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

《中國藥典》2020年版分別只收載了人參和人參葉中人參皂苷Re、Rg1、Rb1以及人參皂苷Rg1、Re的檢測方法和質(zhì)量指標［1］，相關地方標準也未收載人參花的質(zhì)量控制標準。在實際檢測中，由于人參葉和人參花中含有多種皂苷和色素、氨基酸、糖類等成分，在常規(guī)液相色譜檢測中無法準確進行定量。為進一步分離、凈化目標物質(zhì)，本研究選擇Alumina－N/XAD-2SPE Cartridge復合固相萃取柱作為前處理的凈化柱，柱填料分別為XAD－2大孔吸附樹脂和中性氧化鋁，通過XAD－2大孔樹脂的分子排阻作用對樣品中的糖類、蛋白質(zhì)和有機酸等進行洗脫［21］，通過中性氧化鋁對樣品中的色素、黃酮類物質(zhì)進行吸附，從而使人參皂苷類物質(zhì)得到進一步富集、凈化。此外，還對提取溶劑、提取工藝和提取時間進行了優(yōu)化：研究了不同比例的提取溶劑，發(fā)現(xiàn)以水飽和的正丁醇溶液為提取溶劑對人參皂苷的提取率最高；與回流法和索氏提取法相比，超聲提取法簡單、重復性好、效果好；粉碎后的樣品分別用水飽和的正丁醇溶液提取10、20、30、40、50、60min，結(jié)果顯示，30min后提取的人參皂苷含量基本不變，因此最佳超聲提取時間為30min。優(yōu)化的固相萃取條件如“1.3.2 ”所示。

2.4 基質(zhì)效應的考察

選取人參、人參葉、人參花樣品，分別比較固相萃取前、后3種基質(zhì)對10種目標物質(zhì)的影響，并以通過標準加入法計算供試品溶液與對照品溶液相應濃度點的峰面積比值表示基質(zhì)效應因子（MF），MF值越接近1，表明基質(zhì)效應越低。結(jié)果顯示，10種目標化合物固相萃取凈化前在人參、人參葉和人參花樣品中的MF值分別為0.819 ～0.903 、0.757 ～0.896 、0.775 ～0.923 ；經(jīng)固相萃取凈化后的MF值分別為0.945 ～0.988 、0.925 ～0.971 、0.901 ～0.979 。說明樣品經(jīng)固相萃取的分離凈化和稀釋后，較好地消除了基質(zhì)效應，保證了定性定量結(jié)果的準確、可靠。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性關系、檢出限及定量下限分別精密量取混合對照品溶液適量，用甲醇－水（30∶70）稀釋，混勻制得系列混合對照品溶液。采用本方法進樣測定，以系列混合對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標（X，ng/mL），質(zhì)譜峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸；并以線性方程中最低添加濃度的數(shù)據(jù)，分別根據(jù)3倍和10倍信噪比計算人參皂苷的檢出限（LOD）與定量下限（LOQ）。結(jié)果表明，10種目標物質(zhì)均在5～2500ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)（r）不小于0.9980 ；LOD和LOQ分別為0.25 ～2.5 mg/kg和0.75 ～7.5 mg/kg（見表2）。

2.5.2 方法回收率及相對標準偏差以人參葉為典型樣品，分別取同一批次人參葉樣品，添加適量的高、中、低濃度混合標準品溶液，每個水平做6個平行樣，按上述供試品溶液制備方法和色譜質(zhì)譜條件進行分析，計算各人參皂苷的回收率和相對標準偏差（RSD），結(jié)果見表2。結(jié)果表明，樣品中10種人參皂苷的回收率為87.3 %～110%，RSD為1.4 %～9.3 %，說明該方法具有良好的準確度和精密度。

表2 10種人參皂苷的線性關系、檢出限、定量下限、回收率及相對標準偏差Table2 Linear relations，LODs，LOQs，recoveries and RSDs of10analytes

2.5.3 穩(wěn)定性取同一批次人參葉供試品溶液，分別于放置0、4、8、12、24h時進樣測定，并計算相應的RSD。結(jié)果表明，在24h內(nèi)10種人參皂苷的響應值RSD均小于5.5%，表明方法穩(wěn)定性較好，滿足日常檢測需求。

2.6 實際樣品的檢測

分別取不同批次人參、人參葉和人參花樣品各3批，按上述方法進行測定，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，人參、人參葉和人參花樣品均能檢出10種人參皂苷，10種人參皂苷在人參根部的總量為13.44 ～20.11 mg/g，在人參葉中為56.83 ～59.81 mg/g，在人參花中為62.02 ～87.83 mg/g。除了人參皂苷Rf、Rb1外，另8種人參皂苷在人參葉和人參花中的含量更高，特別是人參皂苷Re、Rc和Rd，在人參葉和人參花中的含量顯著高于人參根部。

表3 人參、人參葉和人參花樣品中10種人參皂苷的含量（mg/g）Table3 Contents of10ginsenosides in roots，leaves and flowers of ginseng（mg/g）

3 結(jié) 論

人參的傳統(tǒng)藥用部位為根部，作為人參種植的副產(chǎn)物，人參葉和人參花大部分被遺棄，少部分以代用茶或化妝品原材料的形式被加以利用［22］。本文通過對人參與人參葉、花中的實際檢測結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)人參葉、花所含成分與人參相似，且部分人參皂苷單體和10種主要人參皂苷總量均遠大于人參根部。由于人參的根和根莖的生長周期較長，通過進一步科學、充分利用這些人參副產(chǎn)物，可以延長人參產(chǎn)業(yè)鏈，優(yōu)化產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，同時擴大人參藥材的使用范圍，使藥材資源利用最大化，并減少人參的需求量及森林植被和環(huán)境的破壞。