液相色譜-串聯質譜法同時快速測定嬰幼兒谷物食品中3種莨菪烷生物堿

胡 俠，付麗莎

(大連產品質量檢驗檢測研究院有限公司，遼寧 大連 116023)

阿托品、東莨菪堿和山莨菪堿均屬于莨菪烷類生物堿，含此類生物堿的植物分布廣泛，誤食它們能引起攝食者輕微的肝損傷，嚴重時可能對神經系統、消化系統造成損害，甚至出現內分泌失調等癥狀[1]。隨著農業機械化程度的發展，人們在收獲米粉、高粱、蕎麥等谷物時，含有莨菪烷類生物堿的植物混入原料中的風險增大，以這些原料加工成嬰幼兒谷物的加工食品，含有莨菪烷類生物堿的可能性加大。歐盟等國和地區允許莨菪烷類生物堿嬰幼兒谷物食品中的阿托品、東莨菪堿殘留限量為1.0 μg·kg-1。為保障嬰幼兒谷物食品產品質量安全，建立嬰幼兒谷物食品中莨菪烷類生物堿殘留的檢測方法是非常必要的。

目前，國內外莨菪烷類生物堿含量的測定方法有液相色譜法(HPLC)[2-5]、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[6]、液相色譜-串聯質譜法[7-12](LC-MS/MS)和毛細管電泳法[13-14]等，主要集中在體液、藥物和藥用植物中莨菪烷類生物堿的測定，嬰幼兒谷物食品中3種莨菪烷類生物堿的測定方法還未見報道。因此，本研究以液相色譜串聯質譜法( LC-MS/MS) 為檢測手段，建立了嬰幼兒谷物食品中3種莨菪烷類生物堿的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 6460 Triple Quad LC/MS(Agilent公司)；CR21GIII高速離心機(日本Hitachi公司)；超聲波清洗儀(昆山禾創儀器有限公司)；N-EVAP-24氮吹儀(美國Organomation Associates公司)；固相萃取裝置(Supelco公司)；Sartorius arium61315 超純水發生器(德國Sartorius公司)；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純；實驗用水為高純水，消旋山莨菪堿標準品 (上海源葉生物科技有限公司)，東莨菪堿標準品(J&K公司 )，阿托品標準品 (Dr.Ehrenstorfer公司 )

Oasis HLB(60 mg·3 mL-1)、PRIME HLB柱

(200 mg·6 mL-1，)、C18固相萃取柱(60 mg·3 mL-1)采自Waters公司。

樣品為市售嬰幼兒谷物食品(米粉、蕎麥面條和高粱面條)。

1.2 標準溶液的配制

稱取適量各標準品，分別用甲醇溶解，配成1000 mg·L-1的單標準儲備液，于-18℃ 下避光保存，有效期6個月。移取各單標準儲備液，用甲醇稀釋成10.0 mg·L-1的混合中間溶液，避光保存，有效期3個月。按照1.3操作方法所述制得空白樣品提取液，上機前制成合適濃度的系列基質標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

準確稱取2.5 g試樣于50 mL離心管中，加入5 mL 80%(v/v)乙腈水溶液，勻漿2 min，超聲10 min，在4℃下以10000 r·min-1離心3 min，轉移全部上清液于10 mL帶刻度比色管中備用。重復提取一次，合并提取液，用80%乙腈水溶液定容至10 mL，混勻備用。

取4.0 mL上清備用液于Oasis PRiME HLB柱上，流干后，收集流出液，于45℃下水浴中氮氣吹干。用1.0mL0.1%(v/v)甲酸水溶液復溶，溶液經0.22 μm微孔濾膜過濾后待測。

1.4 色譜條件

選用Agilent Poroshell 120EC-C18(2.7 μm，3.0 mm×75 mm)色譜柱；柱溫：30℃；流動相：A為0.1%(v/v)甲酸水溶液，B為0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～0.5 min，5% B；0.5～1.0 min，10% B；1.0～3.0 min，20% B；3.0～6.0 min，50% B；6.0～8.0 min，90% B；8.1～9.0 min，5% B；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：5μL 。

1.5 質譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，在ESI+掃描模式下檢測；掃描模式為多反應離子監測(MRM)，霧化氣壓力：38 MPa；離子噴霧電壓：4000 V；干燥氣(N2)溫度：350℃；干燥氣流速：10 L·min-1；優化后的質譜參數見表1。

表1 3種莨菪烷類生物堿的質譜參數

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優化

比較了水-甲醇或水-乙腈組成體系中酸(甲酸、乙酸)的種類及添加比例對分離3種莨菪烷類藥物的影響。實驗表明：當流動相為水-乙腈時，在液相色譜分離系統中3種莨菪烷類藥物上的色譜行為優于流動相為水-甲醇時。當流動相為水-乙腈時，酸(甲酸、乙酸)的添加比例在0.05%，0.1%，0.2%，0.3%條件下，目標化合物的色譜保留行為。結果顯示酸添加比例在0.1%以上時，3種莨菪烷類藥物的色譜行為沒有太大的變化，加甲酸時各化合物響應信號更強、分離度更好、基線噪音較低。因此選擇0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈作流動相。

采用選定的流動相和色譜柱，優化梯度洗脫程序，所有待測物都得到良好峰形和較高靈敏度。山莨菪堿的化學結構為莨菪酸-6β羥基-3α-莨菪酯與阿托品相比在莨菪烷母核上多了一個6β羥基，因此山莨菪堿存在四個光學異構體。消旋山莨菪堿有兩個光學異構體， 所以在色譜柱上有2個色譜峰[15]。2.0μg·kg-1添加水平下，米粉中目標化合物的總離子流色譜圖如圖1。

配制濃度為1.0 mg·L-1的3種莨菪烷類生物堿的標準溶液，選擇不同的電離模式，對各個目標物進行一級質譜掃描，結果表明各個目標化合物[M+H]+母離子相應最高。 然后對各個目標化合物進行碰撞電壓、碰撞能進行優化，使選定的特征碎片離子強度達到最大。最后，對方法的噴霧電壓、干燥氣壓力、離子源溫度等參數進行了優化，最終確定各個目標化合物最佳的質譜條件，如圖1，其中1為消旋山莨菪堿，2為東莨菪堿 ，3為阿托品。

圖1 米粉中3種莨菪烷類藥物的總離子流圖

2.2 樣品提取與凈化條件的選擇

試驗比較了甲醇、乙腈作為提取試劑，對3種莨菪烷類生物堿 提取效果，結果表明乙腈較甲醇具有較高的回收率。由于莨菪烷類生物堿親水性不同，在乙腈中加入一定比例的水可滿足莨菪烷類生物堿的提取需要。本研究選用體積分數為 60%、80%、90% 的乙腈水溶液為提取試劑進行提取試驗。 結果表明：當提取溶液中乙腈體積分數為 80% 時，能兼顧3種莨菪烷類生物堿的提取效率，通過2 次分步提取，3種莨菪烷類生物堿均能獲得滿意的提取效果，回收率為86.8%～103.3%。

谷物類植物中成份復雜， 這些物質不僅干擾LC-MS/MS分析，還會影響色譜柱的分辨率，甚至污染質譜儀。菪烷類生物堿的凈化手段大多采用富集濃縮類型的 SPE方法，該類方法涉及溶劑替換、SPE柱的活化、上樣、淋洗和洗脫等操作步驟，耗費時間較長。新型的親水親脂反相固相萃取吸附劑的Oasis PRiME HLB 可以在高比例的有機相條件下，可有效去除基質中的蛋白類、磷脂類干擾物，達到對樣品進行凈化的目的。按照1.3節方法獲得空白米粉提

取液3份，添加10.0 μg·kg-13種莨菪烷類藥物，分別取4 mL提取液通過C18、Oasis HLB和Oasis PRiME HLB小柱，收集流出液，于45℃下水浴中氮氣吹干。分別用1.0mL0.1%(v/v)甲酸水溶液復溶，觀察復溶液顏色，結果表明通過Oasis PRiME HLB柱凈化的溶液最為清澈，且 3種莨菪烷類生物堿回收率最高，詳見表2。

2.3 線性關系

對 6 份空白米粉樣品進行提取凈化并吹干，依次加入用 0.1%加酸水溶液配制成的 0、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg·L-1L的系列標準溶液1.0 mL，充分溶解后制得系列基質匹配標準溶液，過濾后，在選定的儀器條件下進行分析。以測得的各目標物定量離子色譜峰面積 y為縱坐標，質量濃度 xμg·L-1為橫坐標，繪制標準曲線，3種莨菪生物堿在1.0～50.0 μg·L-1內呈現良好的線性關系， 相關系數(R2)均大于0.999，結果見表3。

表3 3種莨菪生物堿的基質匹配標準溶液線性方程、線性相關系數

2.4 方法的靈敏度和精密度

采用在空白米粉中添加目標化合物的方法，依據特征離子色譜峰的 S/N>3為方法的檢出限， S/N>10為方法的定量限，得出阿托品、消旋山莨菪堿、東莨菪堿的檢出限為 0.5 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1。

以空白米粉為樣品，制備添加 1.0、2.0、10.0 μg·kg-13個水平的樣品進行測定，每個添加水平重復測定 6個樣品，連續 3 d 重復操作，最終結果見表4。3種莨菪生物堿在空白米粉中的平均添加回收率為 86.8%～103.3%，日內、日間相對標準偏差(RSD)均小于10%，方法回收率和 RSD均符合實驗室質量控制規范(GB/T27404-2008)的要求。

表4 米粉樣品中3種莨菪生物堿添加回收率實驗結果

2.5 實際樣品測定

實驗對30例市售米粉、蕎麥面條和高粱面條進行了檢測，結果表明所有樣品中均未檢出3種莨菪生物堿。這可能與樣品的抽取數量少及樣品的來源單一有關，本方法可以作為方法儲備為以后的風險監測提供有力的技術保障。

3 結 語

樣品用80%乙腈提取后，經固相萃取柱凈化、高效液相色譜分離、串聯四極桿質譜檢測，成功建立了嬰幼兒谷物食品中3種莨菪生物堿的檢測方法。該方法具有快速簡便、靈敏度高等特點，為其他植物源性食品中莨菪生物堿的檢測提供了有利工具。