ETF在乳腺癌組織中的表達及對乳腺癌細胞增殖的影響

趙璐，孫茂偉，鄒鵬?

（1.沈陽醫學院基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，遼寧 沈陽110034；2.沈陽市積水潭醫院普外科）

乳腺癌是導致女性癌癥患者死亡的第二大因素，僅次于肺癌［1］。近年，其發病率持續上升，是威脅女性健康的惡性腫瘤之一［2］。目前，手術切除是治療乳腺癌的首選方案，隨著醫學技術的不斷發展，結合化療、內分泌治療、放射治療、分子靶向治療等方法能夠提高患者的生存質量和生存期［3－4］。但是由于乳腺癌本身在組織水平、治療反應、遠端轉移位點等方面都存在極高異質性，即使相同的臨床病例特征患者，也會出現不同的治療反應和臨床預后，因此僅從臨床病例特征對患者進行診斷和預后較為片面，新的診斷標記物的發現勢在必得，可為乳腺癌診斷、預后以及治療提供依據［5］。轉錄因子ETF（TEA domain family member 2或TEAD2）屬于TEF家族，其N－末端含有一個由72個氨基酸組成的TEA DNA結構域［6］。研究表明該家族成員能夠參與多種信號通路，在腫瘤形成、轉移、代謝、免疫和耐藥過程中起重要作用［7］。趙璐等［8］研究發現ETF通過MAPK－ERK信號通路促進肝癌細胞的惡性增殖。Sebastian等［9］在膠原單層培養基上培養C57BL／6N小鼠肝細胞72 h后，發現與細胞周期相關的基因表達上調，其中包括ETF，能夠增強細胞的基礎增殖頻率。ETF通過其C端反式激活結構域與YAP／TAZ的N端 相 互 作 用，形 成YAP／TAZTEAD復合物，構成Hippo途徑的核轉錄模塊，在乳腺癌細胞增殖、腫瘤形成等發揮作用［10］。但鮮見ETF對乳腺癌細胞周期影響的報道。本研究擬探討ETF在乳腺癌組織及細胞中的表達情況，以及ETF對乳腺癌細胞增殖能力的影響，為乳腺癌診斷、治療及預后評估提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年1月至2020年12月沈陽市積水潭醫院普外科收治的76例乳腺癌患者的臨床資料。納入標準：（1）所有患者均為女性；（2）術后經病理組織學確診為原發性乳腺癌，術前未進行放化療等治療；（3）手術切除的均有原發性乳腺癌組織和相應癌旁組織；（4）病例記錄完整。排除標準：（1）年齡大于80歲；（2）伴有其他腫瘤；（3）經受過其他治療；（4）臨床資料不完整；（5）不愿參加本研究。患者年齡29~73歲，平均（57.47±7.96）歲。腫瘤及癌旁組織均取自同一患者，留取組織標本置于生理鹽水中，去除組織標本上的血污后，置于液氮保存待用。本研究經醫院倫理委員會批準，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 藥品與試劑 人乳腺癌MDA－MB－231／MCF－7細胞和人正常乳腺細胞MCF10A（美國ATCC公司）；DMEM培養基、胎牛血清（FBS）（Gibco公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；慢病毒包裝試劑盒（合肥知恩生物公司）；細胞全蛋白提取試劑盒（凱 基 生 物 公 司）；抗 體ETF、Cyclin D1、CDK4、CDK6、Cyclin E1、RB、p－RB（美國Cell Signaling Technology公司），二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；BCA蛋白定量試劑、ECL發光劑、CCK－8細胞增殖試劑盒（碧云天生物科技有限公司）；SuperScriptⅢ試劑盒（Invitrogen公司）；其他化學試劑（生工生物有限公司）。

1.3 主要儀器 Western blot及轉膜設備（BioRad公司）；顯影機（廣州博鷺騰生物有限公司）；StepOne型號熒光定量PCR（美國AB Applied Bio?systems公司）；紫外吸收光度儀（BioRad公司）；流式細胞儀（Becton Dickinson公司）。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化 將76例乳腺癌組織和癌旁組織切片后，置于60℃烘箱中烘烤20 min；二甲苯脫蠟2次，每次5 min；分別采用無水、95%、70%的乙醇脫水各2次；3%雙氧水甲醇處理切片，抑制內源性過氧化物酶活性；羊血清封閉2 h。ETF抗體1∶200處理后樣本，4℃過夜。次日，PBS清洗3次后加入二抗，二氨基聯苯胺顯色。

1.4.2 細胞培養、分組和細胞轉染 人正常乳腺細胞MCF10A、人乳腺癌MDA－MB－231／MCF－7細胞培養于10% FBS DMEM培養基，置于37℃5% CO2培養箱，待細胞進入對數生長期進行實驗。根據慢病毒包裝試劑盒說明書進行操作，把感染的MDA－MB－231／MCF－7細胞培養72 h，收集培育中的清液，即慢病毒液。隨即采用嘌呤霉素篩選感染的靶細胞，挑選出MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組和陰性對照組MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC，未感染MDA－MB－231／MCF－7細胞作為空白對照組。

1.4.3 RT－qPCR 分別檢測76例乳腺癌組織和相應癌旁組織、MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC和MDA－MB－231／MCF－7細胞中相關因子mRNA表達。采用Trizol試劑裂解組織或細胞，按照RNA提取試劑盒說明書進行。采用反轉錄試劑盒進行反轉錄，獲得cDNA。采用SYBR試劑盒進行RT－PCR，PCR反應體系進行40個循環。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.4 Western blot法 分別檢測76例乳腺癌組織和相應癌旁組織，MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC和MDAMB－231／MCF－7細胞中相關蛋白表達。按照細胞全蛋白提取試劑盒說明書進行蛋白提取，采用NP40裂解液將組織勻漿或細胞吹散，計算樣本蛋白濃度。取30 μg全蛋白于15% SDS－PAGE進行分離，電轉至NC膜，將脫脂奶粉于室溫封閉1 h；一抗4℃過夜，二抗37℃1 h；ECL發光。

1.4.5 細胞增殖實驗 將MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC和MDA－MB－231／MCF－7組細胞制成4×105個／ml細胞懸液，接種于96孔板中，按照CCK－8細胞增殖試劑盒說明書進行操作，按照0、12、24、36、72、96 h進行時間設定，檢測前4 h每孔加入5 μl CCK－8試劑，棄培養液，在450 nm處測定吸光度值（OD）值。OD代表細胞數目，每組3個復孔。

1.4.6 流式細胞儀檢測細胞周期 將MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC和MDA－MB－231／MCF－7組細胞制成5×106個／ml細胞懸液置于24孔板，按照細胞周期檢測試劑盒說明書進行操作，加入實驗用培養基，48 h后，PBS洗滌2次，離心收集細胞。70%乙醇固定4℃過夜，次日PBS洗滌3次，加入1 mg／ml PI染液，室溫避光孵育30 min后，檢測細胞周期分布。

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析和獨立樣本t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ETF在乳腺癌及癌旁組織中的表達 免疫組化結果顯示，在76例乳腺癌組織和癌旁組織中，ETF蛋白表達的陽性率分別為73.68%（56／76）和17.11%（13／76） （χ2＝49.070，P＜0.01）。ETF蛋白主要定位在細胞質中，圖1A。RT－qPCR和Western blot檢測結果顯示，ETF在乳腺癌組織中mRNA及蛋白表達水平均顯著高于癌旁組織（P＜0.01），見圖1B、C。

圖1 ETF在乳腺癌及癌旁組織中的表達

2.2 ETF對乳腺癌細胞增殖的影響 利用慢病毒感染的方式構建過表達ETF MDA－MB－231／MCF－7細胞株，檢測ETF對乳腺癌細胞增殖的影響。首先采用RT－qPCR和Western blot檢測MCF10A組、MDA－MB－231／MCF－7組、MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC組中ETF表達情況，結果顯示ETF在MDA－MB－231／MCF－7細胞中的表達顯著高于MCF10A細胞（P＜0.01），ETF在乳腺癌細胞中過表達。ETF在MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組中的表達顯著高于陰性對照組與空白對照組（P＜0.01），成功構建ETF過表達的乳腺癌細胞系，見圖2A－B。采用CCK－8實驗檢測不同細胞組的增殖情況，結果顯示在各個時間點MDA－MB－231與MDA－MB－231－NC、MCF－7與MCF－7－NC組細胞增殖差異無統計學意義（P＞0.05）。而在48、72、96 h處，與MDA－MB－231／MCF－7組細胞比較，MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組細胞增殖顯著增強（P＜0.01），見圖2C。

圖2 ETF對MDA－MB－231／MCF－7細胞增殖的影響

2.3 ETF對乳腺癌細胞周期的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，與MDA－MB－231／MCF－7、MDAMB－231－NC／MCF－7－NC組相比，MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組細胞周期中G1／S期細胞比例顯著降低（P＜0.01），G2／M期細胞比例顯著增加（P＜0.01），細胞周期進程加快（P＜0.01），見圖3A。RT－qPCR和Western blot結果顯示，與MDA－MB－231／MCF－7、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC組相比，MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組Cyclin D1、CDK4、CDK6、Cyclin E1 mRNA和蛋白表達均顯著高于陰性對照組和空白對照組（P＜0.01），RB mRNA和蛋白水平與陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），但其磷酸化蛋白水平顯著高于陰性對照組和空白對照組（P＜0.01），見圖3B、C。

圖3 ETF對MDA－MB－231／MCF－7細胞周期及相關細胞周期蛋白的影響

3 討論

乳腺癌是女性惡性腫瘤發病率最高的癌癥，預估到2020年，全球乳腺癌患者將達1 785萬，且呈年輕化趨勢［11］。因此，研究乳腺癌發病的分子機制，尋找能夠大大提高乳腺癌早期診斷的腫瘤標志物就顯得尤為重要。

轉錄因子ETF的轉錄產物在腫瘤發展過程中起著重要作用，與人類惡性腫瘤的臨床病理參數密切相關，可作為判斷預后的生物標志物。在肝癌組織中ETF和VGLL4 mRNA的表達均顯著高于正常對照組，且在晚期患者的肝癌組織中ETF mRNA的表達高于早期患者，且ETF和VGLL4 mRNA高表達與上皮－間充質轉化和血管生成有關，提示ETF和VGLL4在腫瘤發生發展進展中發揮重要作用［12］。在神經膠質瘤U87－MG、LN229細胞中發現YAP1促進ETF入核，且復合物能夠直接作用MES基因啟動子，進而調控腫瘤細胞周期進程［13］。

目前鮮見關于ETF對乳腺癌增殖影響的報道，因此本研究檢測ETF在乳腺癌組織中的表達情況，結果顯示其在乳腺癌組織中的陽性率顯著升高，與體外細胞中檢測結果相似，提示ETF蛋白高表達可能與乳腺癌的發生發展密切相關。在體外構建高表達ETF蛋白的乳腺癌細胞系，并檢測ETF對乳腺癌細胞增殖的影響，結果顯示ETF能夠促進乳腺癌細胞的增殖。在對機制研究中發現，ETF能夠通過提升G2／M期細胞比例，使細胞周期進程加快。在檢測周期相關蛋白表達時發現，Cyclin D1、CDK4、CDK6、Cyclin E1和p－RB在MDAMB－231－ETF／MCF－7－ETF組表達量顯著高于陰性對照組和空白對照組，因此，提示在乳腺癌細胞穩 轉ETF后，通 過 提 高Cyclin D1、CDK4、CDK6、Cyclin E1和p－RB的表達，使細胞更快速通過G1／S期，G2／M期細胞比例高，加快細胞周期進程。RB是抑癌基因，非磷酸化形式存在于G0／G1期，磷酸化形式存在于S／G2期，RB過度磷酸化是其失活的重要機制，進而導致細胞周期及細胞增殖異常［14－15］。提示ETF通過調節周期相關蛋白表達加速乳腺癌細胞增殖。

綜上所述，ETF與乳腺癌發生發展密切相關，可成為潛在的臨床早期診斷及不良預后的標記物。接下來本課題組將會繼續探究ETF對乳腺癌細胞凋亡、侵襲轉移等方面的影響，為乳腺癌的發生發展的標志物和潛在的重要靶點奠定理論基礎。