HPLC法測定雙烏扶筋膏中川續斷皂苷Ⅵ的含量

崔思嬌，張大軍，巴琳，汪宇，欒天?

（1.沈陽醫學院藥學院化學教研室，遼寧 沈陽110034；2.中國人民解放軍北部戰區空軍醫院藥劑科）

膏藥作為中醫傳統劑型應用至今已有千余年的歷史，從《中國藥典》1977年版［1］首次將膏藥作為一個單獨劑型收載，到《中國藥典》2015年版［2］對膏藥外觀性狀、貯藏條件和檢查項目等作以具體規定，膏藥的質量標準逐步提升，但依舊缺少反映黑膏藥質量的客觀指標和檢測方法，因而現階段質量控制仍多憑借經驗判斷。目前國內對黑膏藥質量的研究鮮見報道［3－6］，可能是因為其處方復雜，多味中藥成分相互作用，炮制過程中產生新的物質，難以選擇代表性的成分作為控制指標；制劑工藝均需高溫油炸，導致其成分多被破壞；黏性大、吸附性強的基質加大了分析時處理樣品的難度。

雙烏扶筋膏是中國人民解放軍北部戰區空軍醫院自主研發生產的黑膏藥制劑，主要由生草烏、生川烏、生南星、川牛膝、續斷等多味中藥組成。具有軟堅散結、祛瘀消腫、散寒定痛、舒筋活絡功效，用于骨質增生、頸椎病、肩周炎、腰椎病、風濕、類風濕引起的筋骨疼痛等癥，經臨床應用多年，療效顯著，但其質量標準中尚無含量測定標準。續斷是雙烏扶筋膏的主藥，其有效成分川續斷皂苷Ⅵ（圖1），經現代藥理學證實，其具有保護骨組織﹑抗炎﹑鎮痛等藥理活性，并且能夠多靶點發揮藥效［7］。因此，可選擇川續斷皂苷Ⅵ作為雙烏扶筋膏的質量控制指標。目前，有關黑膏藥的制劑中，以HPLC對其中的藥物進行含量測定的方法鮮有報道。為提升雙烏扶筋膏的質量標準，本研究建立了雙烏扶筋膏中主要成分之一川續斷皂苷Ⅵ的HPLC含量測定方法。

圖1 川續斷皂苷Ⅵ的化學結構

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent Technologies 1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀（美國Agilent公司），AUW220D電子分析天平（日本Shimadzu公司），HH·S電熱恒溫水浴鍋（江蘇紅旗醫療器械廠），旋轉蒸發器RE－520A（上海亞榮生化儀器廠），SHB－Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）。

1.2 試藥 雙烏扶筋膏樣品為中國人民解放軍北部戰區空軍醫院制劑室生產（批號20191228、20200121、20200310），規格為10 g／貼。川續斷皂苷Ⅵ對 照 品（批 號111685－201707，純 度90.9%）購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈、甲醇、色譜純為天津市四友精細化學品有限公司；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件［8－10］Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈－0.1%磷酸水溶液（26∶74，V／V），檢測波長為212 nm，流速1.0 ml／min，柱溫30℃，進樣量10 μl。

2.2 單因素試驗 首先將提取時間固定為3.0 h，取雙烏扶筋膏樣品（批號20200121）6貼，置－20℃冰箱中冷凍1 h后取出，剝離藥物，搗碎，混勻，稱取本品膏體約50 g，精密稱定，置錐形瓶中，加水500 ml，分別在50﹑60﹑70﹑80及90℃下進行水浴提取，放冷，過濾取濾液。蒸干濾液，殘渣加30 ml甲醇溶解，過濾取濾液，濃縮，定容至5 ml量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液備用，按2.1項下色譜條件進行測定，其提取溫度與之對應的樣品含量測定結果見表1。隨后，將提取溫度固定為80℃，提取時間依次設定為1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 h，按上述同樣方法測得提取時間與對應的樣品含量，結果見表2。

表1 川續斷皂苷Ⅵ的含量與提取溫度

表2 川續斷皂苷Ⅵ的含量與提取時間

2.3 溶液的制備 （1）對照品溶液的制備：精密稱取川續斷皂苷Ⅵ對照品適量，加甲醇制成0.5 mg／ml的對照品溶液。（2）供試品溶液的制備：取雙烏扶筋膏6貼，置－20℃冰箱中冷凍1 h后取出，剝離藥物，搗碎，混勻，稱取本品膏體約50 g，精密稱定，置錐形瓶中加水500 ml，80℃下水浴提取2.5 h，放冷，過濾取濾液。蒸干濾液，殘渣加30 ml甲醇溶解，過濾取濾液，濃縮，定容至5 ml量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液備用。（3）陰性對照品溶液的制備：按處方量并以相同工藝制備不含續斷的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制得陰性對照品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統適應性試驗 精密吸取2.3項下對照品、供試品、陰性對照品溶液各適量，按照2.1項下色譜條件測定。理論塔板數按川續斷皂苷Ⅵ峰計算不低于3 000，分離度大于1.5。色譜圖見圖2。

圖2 雙烏扶筋膏的HPLC圖

2.4.2 線性關系考察 將2.3項下對照品溶液稀釋成5個質量濃度的溶液，依次為20、50、100、250、500 μg／ml，按2.1項下色譜條件依次進樣測定。以峰面積（Y）對質量濃度（X）進行線性回歸，得到川續斷皂苷Ⅵ對照品回歸方程Y＝3.935 4X－1.497 8，r2＝0.999 9。結果表明川續斷皂苷Ⅵ在20~500 μg／ml范圍內質量濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.4.3 精密度試驗 吸取對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續重復進樣6次，測得川續斷皂苷Ⅵ峰面積RSD為0.37%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.4.4 重復性試驗 取雙烏扶筋膏（批號20200121）6份，依照2.3項下方法制備供試品溶液，依次進樣，結果顯示川續斷皂苷Ⅵ的平均濃度為0.228 mg／ml，RSD為1.33%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 穩定性試驗 吸取供試品溶液（批號20200121）于0、4、8、12、16、24 h依次進樣并計算含量，結果顯示川續斷皂苷Ⅵ含量測定的RSD為1.31%。表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.6 加樣回收試驗 取已知含量的雙烏扶筋膏（批號20200121，含量20.4 μg／g）6份，精密稱定，分別準確加入川續斷皂苷Ⅵ對照品適量，按2.3項下方法制成供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，結果顯示川續斷皂苷Ⅵ的平均回收率為96.74%，RSD為1.49%（n＝6），結果表明該方法的回收率良好。見表3。

表3 雙烏扶筋膏中川續斷皂苷Ⅵ加樣回收率試驗結果（n＝6）

2.5 樣品含量測定 取批號為20191228、20200121、20200310的雙烏扶筋膏樣品各約50 g，精密稱定后，按2.3項下制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，以外標法計算川續斷皂苷Ⅵ的含量。實驗結果見表4。

表4 雙烏扶筋膏中川續斷皂苷Ⅵ的含量測定結果

3 討論

川續斷皂苷Ⅵ為糖苷取代的五環三萜類化合物，其化學結構如圖1所示，因其結構中存在大量的醇羥基，故此，其在醇類溶劑以及水中溶解度較高，并且隨著溫度的升高其溶解度顯著增加。因此，在提取溶劑的選擇中，本研究選擇甲醇、乙醇、水三種提取溶劑進行比較。結果顯示，甲醇與水的提取率相對較高，但以水為提取溶劑制備的供試品溶液所得圖譜中雜質峰較少，與其他雜質峰分離度較好，且基線平穩，因此本研究選用水作為提取溶劑。

在提取方式的考察中，以水為溶劑首先考察了回流提取法，發現大量基質溶于提取液中，以致提取液濃縮后過于黏稠，無法通過微孔濾膜處理檢測。其次考察了超聲提取法，發現超聲提取后供試品呈膏體狀聚集，制得的供試品中川續斷皂苷Ⅵ含量極低，其原因可能是因為樣品中大量基質經過長時間超聲軟化聚集，使得藥物有效成分粘附在基質中，造成有效成分的損失。最后，本研究選擇在80℃下進行水浴提取法，試驗結果表明，制得的供試品溶液澄清，提取率較高且所得供試品溶液圖譜中雜質峰較少，因此選擇水浴提取方式進行供試品溶液的制備。

在提取溫度與時間的考察中，在提取溫度上分別進行了50、60、70、80及90℃下的提取試驗，結果顯示，提取溫度為80℃時川續斷皂苷Ⅵ含量最高，當溫度上升到90℃時，提取液黏度大大增加，較難過濾，且含量不再增加，故此將提取溫度確定為80℃。隨后，在提取時間上分別進行了1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 h的提取試驗，結果顯示，在80℃水浴提取2.5 h后，所制得的供試品樣品中川續斷皂苷Ⅵ含量無顯著變化，考慮到試驗時間和能源成本，本研究最終將水浴提取溫度確定為80℃，提取時間確定為2.5 h。

綜上所述，本研究采用HPLC法測定雙烏扶筋膏中川續斷皂苷Ⅵ的含量，解決了黑膏藥樣品難處理的問題，采用水浴提取法防止大量基質對主成分含量測定的干擾，提高了雙烏扶筋膏的質量標準，使黑膏藥的質量控制客觀規范化，同時為相關領域的研究提供了參考。