室內空調機濾塵網塵螨、腐食酪螨變應原基因的檢測

薛琪琪，許薇，朱志偉，趙金紅

（皖南醫學院基礎醫學院醫學寄生蟲學教研室，安徽 蕪湖241002）

粉螨分布廣泛，普遍孳生于面粉、儲糧、儲藏食品、中藥材以及居室環境的灰塵中，有些種類可以成為引起人類過敏性疾病的重要過敏原，導致螨性皮炎、螨性哮喘，甚至人體內螨?。?－2］，對人類健康產生危害。室內空調機濾塵網也是粉螨孳生的重要場所，空調運行時可將粉螨產生的大量變應原通過空調風吹入室內空氣中，被人體吸入后可誘發哮喘等過敏性疾病。其中粉塵螨（Dermatophagoides farinae）、屋塵螨（Dermatopha?goides pteronyssinus）和腐食酪螨（Tyrophagus pu?trescentiae）是 粉 螨 中 常 見 的 過 敏 原 種 類［3］。Voorhorst等［4］在1964年的研究已經證明塵螨是屋塵中的主要過敏原之一。Arroyave等［5］的研究顯示，粉塵螨和屋塵螨是最主要的2種吸入性過敏原，可導致全身性過敏性疾病包括過敏性鼻炎、哮喘、變應性球結膜炎、蕁麻疹、特應性濕疹（皮炎）等。近年來，已有研究對空調空氣濾網中屋塵螨、粉塵螨的變應原進行檢測，但尚未涉及其他粉螨變應原的研究。故本研究分別對安徽合肥、蕪湖、淮南、淮北4個地區的室內空調機濾塵網進行采集，檢測空調機濾塵網灰塵中是否含有屋塵螨、粉塵螨和腐食酪螨變應原，為防治由于粉螨引起的過敏性疾病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 高速冷凍離心機（美國Beckman公司）、凝膠電泳成像分析系統（美國Bio－Rad公司）、克隆載體pMD19－T（大連Takara公司）；土壤基因組DNA快速抽提試劑盒（SK8233）、Taq PCR Master Mix、DNA聚合酶和DNA marker均購于上海生物工程有限公司。

1.2 樣本采集 共采集家用空調（包括柜式空調和壁掛式空調）灰塵144份，分別包括蕪湖、合肥、淮北、淮南32份、36份、41份、35份。采集時間為夏季7~9月。采集時取下空調機濾塵網，用毛刷輕輕將灰塵掃入盤中，再將灰塵樣本分別裝入收集管內，記錄采集時間、地點和采集人等信息后備用。

1.3 DNA提取、引物設計和PCR克隆擴增

DNA提取采用土壤基因組DNA快速抽提試劑盒（SK8233）并作稍加改動，根據Genbank公布的粉塵螨1類變應原（Der f 1）（AB034946）、屋塵螨1類變應原（Der p 1）（U11695）以及腐食酪螨1（Tyr p 1）（DQ983317）設計引物序列（表1）。

表1 粉塵螨、屋塵螨、腐食酪螨1類變應原基因引物序列

引物交由通用生物工程有限公司合成。PCR反應總體積為25 μl，含12.5 μl Taq DNA聚合酶、2 μl DNA模板、上下游引物各1 μl、8.5 μl無菌水補足。PCR反應參數：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸60 s，34個循環；72℃終延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖電泳和DNA膠回收試劑盒純化后，連接到載體pMD19－T中，轉化至大腸桿菌（DH5α感受態細胞）中，通過藍白斑篩選，將陽性克隆委托通用生物技術有限公司采用DNA測序儀（ABI－3730）進行測序。

1.4 序列處理與分析 對測序結果利用DNAMAN軟件進行拼接和人工校正，將獲得的核苷酸序列在GenBank數據庫中進行BLAST比對分析，以確定是否為目標片段。為避免PCR擴增可能導致的錯配而造成假象的多態性，本研究中用于數據分析的每條序列在同一個體中至少來自3個陽性克隆。

2 結果

2.1 Der f 1、Der p 1和Tyr p 1擴增結果 以提取的空調機濾塵網灰塵DNA為模版，采用特異性引物擴增Der f 1、Der p 1、Tyr p 1變應原基因，PCR產物經1%瓊脂糖電泳后，144份灰塵樣本中有30份檢測出Der f 1變應原基因，33份檢測出Der p 1變應原基因，10份樣本檢測出Tyr p 1變應原基因。Der f 1基因擴增結果目的片段長度為266 bp，Der p 1基因擴增結果目的片段長度為282 bp，Tyr P 1基因擴增結果目的片段長度為227 bp（圖1）。

2.2 Der f 1、Der p 1和Tyr p 1基因同源性比對結果 本研究檢出安徽地區的Der f 1的基因序列與已知日本東京地區檢出的Der f 1基因（Genbank登錄號AB034946）、泰國地區檢出的Der f 1基因（Genbank登錄號DQ185509）、中國深圳地區檢出的Der f 1基因（Genbank登錄號EF139430）核苷酸序列同源性分別為100%、99.62%、99.62%。

檢出安徽地區的Der p 1的基因序列與澳大利亞的柏斯和悉尼地區檢出的Der p 1基因（Gen?bank登錄號U11695）、美國北卡羅來納州檢出的Der p 1基因序列（Genbank登錄號KJ542093）、中國鹽城地區檢出的Der p 1基因（Genbank登錄號EU148599）核苷酸序列同源性分別為100%、99.64%、98.95%。

檢出安徽地區的Tyr p 1的基因序列與新加坡地區檢出的Tyr p 1基因序列（Genbank登錄號DQ983317）核苷酸同源性為100%。

M：DNA marker；1：粉塵螨1類變應原（Der f 1）；2：屋塵螨1類變應原（Der p 1）；3：腐食酪螨1類變應原（Tyr p 1）圖1 粉塵螨1類變應原（Der f 1）、屋塵螨1類變應原（Der p 1）、腐食酪螨1類變應原（Tyr p 1）擴增產物圖

2.3 不同地區空調機濾塵網灰塵Der f 1、Der p 1和Tyr p 1檢測結果 在安徽省4個不同城市中，對Der f 1、Der p 1和Tyr p 1的基因檢測結果也具有一定的差異。Der f 1、Der p 1和Tyr p 1的陽性檢測結果大多集中在合肥和蕪湖2個城市中，淮北、淮南空調機濾塵網灰塵Der f 1、Der p 1和Tyr p 1檢測的陽性結果較少。144份空調機濾塵網灰塵中，Der f 1基因陽檢出率為20.83%（30／144），Der p 1基因陽性檢出率為22.92%（33／144），Tyr p 1基因陽性檢出率為6.94%（10／144），其中Der f 1和Der p 1基因陽性率較高。同時發現其中16.67%（24／144）的樣本同時檢測出Der f 1和Der p 1 2種變應原，只有2.08%（3／144）的樣本同時檢測出了Der f 1、Der p 1、Tyr p 1 3種粉螨變應原（表2）。

表2 不同地區空調機濾塵網灰塵Der f 1、Der p 1、Tyr p 1檢測結果

3 討論

粉螨是引起過敏性疾病的主要原因之一，而粉塵螨、屋塵螨和腐食酪螨又是居室中常見的螨類。當清理衛生時可以將它們拍起懸浮于空中，被空調吸入并附著于空調機濾塵網中。當空調長期未清理時，濾塵網中就會附著許多灰塵和微生物，其中可能就包括屋塵螨、粉塵螨和腐食酪螨等。當再次開啟空調時，空調機濾塵網中的灰塵就會隨著空調風排入室內空氣內，其灰塵中包含的塵螨變應原就有機會和人體直接或間接接觸，從而導致螨過敏性疾病如螨性皮炎、哮喘和螨病等［8－9］。湛孝東等［10］采用ELISA法檢測了從蕪湖市區不同地區中采集的空調隔塵網灰塵的Der f 1、Der p 1的濃度及灰塵提取液的過敏原性，結果證實蕪湖地區居民空調隔塵網中含有塵螨過敏原。練玉銀等［11］分別對塵螨過敏的哮喘患者家庭及健康家庭進行空調使用前后空氣中和空調濾網中灰塵的塵螨主要變應原進行檢測，發現空調機濾塵網灰塵中存在塵螨抗原，這是室內塵螨變應原的重要來源，可以導致過敏性哮喘。馬忠校等［12］檢測了開啟空氣凈化器前后室內空氣中塵螨主要過敏原的含量變化，發現使用空氣凈化器可明顯降低室內空氣中的塵螨過敏原的濃度。

空調濾塵網灰塵中可含有多種引起過敏性哮喘的螨類。王克霞等［13］采集了安徽省蕪湖市居民空調隔塵網灰塵樣本，進行粉塵螨和屋塵螨1、2、3類變應原基因的檢測，結果發現螨性變應原基因檢出率為85%，其中以粉塵螨和屋塵螨1、2類變應原基因為主。但目前對于空調機濾塵網中是否含有腐食酪螨變應原鮮見報道，故本研究為了進一步證實空調機濾網灰塵中存在塵螨變應原，以及檢測空調機濾塵網中是否含有腐食酪螨變應原，從安徽淮南、淮北、合肥、蕪湖4個地區采集共144份樣本進行檢測，結果顯示，空調機濾塵網中的粉螨變應原基因檢出率最高的是Der p 1（22.92%，33／144），其次為Der f 1（20.83%，30／144）和Tyr p 1（6.94%，10／144）。說明空調機濾塵網中沉積的灰塵中含有屋塵螨、粉塵螨和腐食酪螨變應原，塵螨變應原為空調機濾塵網中的主要變應原。并且本研究結果還發現，在同一份灰塵樣本中可以同時檢測出2種或2種以上塵螨變應原，由此可見，當空調機濾塵網中同時含有粉塵螨、屋塵螨變應原時，也含有腐食酪螨變應原，三者之間并無沖突。本研究中塵螨檢出率低于王克霞等［13］的研究（檢出率為85%，17／20），可能與所采集的空調機濾塵網經過定期清洗次數，或者采集后樣本保存時間等有關。白羽等［14］首次用分子生物學方法證實了深圳地區、北京地區空調濾塵網灰塵中檢測到Der f 1和Der p 1基因，且深圳地區Der f 1和Der p 1基因檢出率為100%，而北京地區空調濾塵網灰塵中同時Der f 1和Der p 1基因的檢出率僅為40%，指出因深圳地區常年溫暖潮濕，更適于粉塵螨和屋塵螨的孳生繁殖。本研究發現，來自于合肥、蕪湖的樣本檢出率高于來自于淮南、淮北的樣本檢出率，也可能是由于合肥、蕪湖處于安徽中部到南部地區，相較于安徽北部氣候較為濕潤，更適宜塵螨和腐食酪螨的孳生。然而目前關于合肥、蕪湖、淮南、淮北地區人群的螨性哮喘發病率比較尚無報道，因此本研究結果可為上述地區人群螨性哮喘發病奠定理論基礎。

綜上所述，安徽合肥、蕪湖、淮南、淮北4個地區的空調機濾塵網中存在塵螨和腐食酪螨變應原，應重視空調的清潔與凈化、定期清洗，并且經常更換隔塵網，可以減少塵螨和腐食酪螨的孳生，有效地降低居住環境中變應原的含量，通過減少致敏因素從而降低過敏性疾病的發病率。