應(yīng)用多色探針熔解曲線(xiàn)分析法檢測(cè)湘潭地區(qū)G6PD缺乏癥基因突變*

李晨輝，王淑媛，袁海斌，殷 偉,劉春梅

湖南省湘潭市婦幼保健院優(yōu)生遺傳科，湖南湘潭 411101

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥是人類(lèi)最常見(jiàn)的遺傳代謝病之一，為X連鎖不完全顯性遺傳病，患有G6PD缺乏癥的新生兒易出現(xiàn)黃疸，嚴(yán)重者可導(dǎo)致腦損傷，甚至死亡[1]。G6PD缺乏癥尚無(wú)特效治療方法，僅能通過(guò)對(duì)癥治療緩解患兒癥狀，我國(guó)是該病的高發(fā)區(qū)之一，呈現(xiàn)“南方高北方低”的分布特點(diǎn)[2-3]。對(duì)新生兒進(jìn)行G6PD缺乏癥早期篩查也是防治新生兒高膽紅素血癥的重要手段[4]。篩查G6PD缺乏癥的方法很多，主要分為酶學(xué)診斷和基因診斷兩大類(lèi)。酶學(xué)診斷簡(jiǎn)便、快捷、價(jià)格低廉，但不同類(lèi)型的基因突變因累積酶的功能部位不同而表型迥異，且該方法不能有效檢出女性雜合子；而基因診斷中，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法需要PCR后處理，易造成PCR產(chǎn)物污染，操作煩瑣、成本高[5]，本院應(yīng)用多色探針熔解曲線(xiàn)分析(MMCA)技術(shù)建立了G6PD基因診斷體系，具有操作簡(jiǎn)單、快捷、高通量、高自動(dòng)化、低成本等優(yōu)勢(shì)。本研究以外顯子基因測(cè)序(Sanger測(cè)序)法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，比較酶活性法與MMCA法在G6PD缺乏癥診斷中的價(jià)值，以期為G6PD缺乏癥的早期診斷提供更有效的方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 2017年1月至2020年9月在本院新生兒疾病篩查中心進(jìn)行G6PD缺乏癥篩查的90 221例新生兒中，初篩陽(yáng)性1 024例，召回952例，以其中454例同時(shí)進(jìn)行G6PD酶活性法檢測(cè)和基因檢測(cè)(MMCA法、Sanger測(cè)序法)的新生兒作為研究對(duì)象，男309例，女145例，年齡3～60 d。納入研究的患兒家屬均對(duì)本研究知情同意。

1.2儀器與試劑 干血斑G6PD熒光定量分析法試劑盒和1420型熒光分析儀購(gòu)于美國(guó)PerkinElmer公司；G6PD定量酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)于北京華宇億康生物工程技術(shù)有限公司，T600型全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本日立公司；G6PD基因突變檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：YZB/國(guó)1217-2015)、Lab-Aid 824全自動(dòng)核酸提取儀及配套核酸提取試劑(貨號(hào)：604001)購(gòu)自廈門(mén)致善生物科技有限公司；SLAN-96S實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

1.3方法

1.3.1新生兒G6PD缺乏癥初篩 取出生后3～7 d新生兒足跟血，制成干血斑，由專(zhuān)人送至新生兒疾病篩查中心集中檢測(cè)。采用G6PD熒光定量分析法進(jìn)行G6PD水平檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。以1 g血紅蛋白中G6PD<2.6 U為初篩陽(yáng)性。

1.3.2酶活性法定量檢測(cè)G6PD水平 采集G6PD缺乏癥初篩陽(yáng)性新生兒靜脈血2 mL(乙二胺四乙酸抗凝)，檢測(cè)紅細(xì)胞G6PD活性，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行檢測(cè)。G6PD參考值為1 700～2 600 U/L，當(dāng)紅細(xì)胞中G6PD<1 700 U/L為G6PD缺乏癥。

1.3.3MMCA法檢測(cè)G6PD基因突變 干血斑標(biāo)本的核酸提取根據(jù)Lab-Aid 824全自動(dòng)核酸提取儀及配套核酸提取試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作?；蚍中筒捎肎6PD基因突變檢測(cè)試劑盒,在SLAN-96S實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果與野生型對(duì)照熔解峰差異來(lái)判讀G6PD基因突變情況。MMCA法采用熒光PCR熔解曲線(xiàn)，根據(jù)靶探針雜交產(chǎn)物熔點(diǎn)的差異檢測(cè)G6PD基因突變，可同時(shí)檢測(cè)12種常見(jiàn)突變類(lèi)型，包括c.95A>G、c.383T>C、c.392G>T、c.487G>A、c.517T>C、c．592C>T、c.871G>A、c.1004C>A、c.1024C>T、c．1360C>T、c.1376G>T、c.1388G>A，以及4種少見(jiàn)突變類(lèi)型(科研位點(diǎn))c.1387C>T、c.493A>G、c.519C>T、c.1381G>T。結(jié)果判讀：比較待測(cè)標(biāo)本與野生型對(duì)照熔解峰之間熔點(diǎn)(Tm值)的差異，ΔTm值在±1 ℃為野生型峰(陰性)，超過(guò)±2 ℃為突變型峰(陽(yáng)性)。通過(guò)查閱人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(HGMD)及文獻(xiàn)鑒定每個(gè)突變位點(diǎn)的性質(zhì)和蛋白功能改變。

1.3.4G6PD基因突變?nèi)蚪M測(cè)序 應(yīng)用Sanger測(cè)序法對(duì)G6PD基因的2～12外顯子及外顯子-內(nèi)含子的剪切區(qū)域進(jìn)行測(cè)序分析,若檢測(cè)出突變基因則為陽(yáng)性,反之為陰性。標(biāo)本測(cè)序由浙江博圣生物技術(shù)股份有限公司完成。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)；診斷結(jié)果的一致性判斷采用Kappa檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13種方法對(duì)G6PD缺乏癥篩查陽(yáng)性新生兒的檢測(cè)結(jié)果比較 在454例同時(shí)進(jìn)行G6PD酶活性法、MMCA法及Sanger測(cè)序法檢測(cè)的新生兒中，酶活性法檢測(cè)出男性陽(yáng)性165例，女性陽(yáng)性25例；MMCA法檢測(cè)出男性陽(yáng)性164例，女性陽(yáng)性42例；Sanger測(cè)序法檢測(cè)出男性陽(yáng)性169例，女性陽(yáng)性42例。見(jiàn)表1。

表1 3種方法對(duì)G6PD缺乏癥篩查陽(yáng)性新生兒的檢測(cè)結(jié)果比較(n)

2.2G6PD活性正常、基因突變陽(yáng)性新生兒情況分析 酶活性法檢測(cè)出的G6PD活性正常新生兒中，21例為G6PD基因突變陽(yáng)性。該21例新生兒出生體質(zhì)量、胎齡均正常，包括4例男性(均有輸血史和黃疸治療史)和17例女性(其中3例有黃疸治療史)。4例男性新生兒酶活性法的檢測(cè)值為1 700～2 000 U/L，G6PD基因突變類(lèi)型全部為c.1376G>T；17例女性新生兒酶活性法的檢測(cè)值>1 900 U/L，G6PD基因突變類(lèi)型為c.1376G>T 8例，c.1388G>A 6例，c.519C>T 1例，c.1024C>T 1例及c.871G>A 1例。

2.3G6PD基因多態(tài)性分布情況 454例新生兒中共檢出G6PD基因突變211例。檢出常見(jiàn)突變類(lèi)型為c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G、c.1024C>T、c.871G>A、c.392G>T、c.487G>A、c.1004C>A、c.1360C>T、c.517T>C；檢出少見(jiàn)突變類(lèi)型為c.519C>T；Sanger測(cè)序法檢出c.1003G>A、c.152C>T、c.585G>T、c.94C>G。G6PD基因突變比例最高的前3位為c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G。MMCA法共檢出11種突變類(lèi)型，其中男性半合子突變10種，女性雜合子突變9種，女性未見(jiàn)純合子和復(fù)合雜合突變。Sanger測(cè)序法檢出15種突變類(lèi)型，其中男性半合子突變14種，女性雜合子突變9種，女性未見(jiàn)純合子和復(fù)合雜合突變。見(jiàn)表2。

表2 G6PD基因多態(tài)性分布情況[n(%)]

續(xù)表2 G6PD基因多態(tài)性分布情況[n(%)]

2.4酶活性法與Sanger測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果比較 以Sanger測(cè)序法為G6PD缺乏癥基因診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，對(duì)酶活性法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，酶活性法診斷男性新生兒G6PD缺乏癥的靈敏度為97.6%(165/169)，特異度為100.0%(140/140)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.0%(165/165)，陰性預(yù)測(cè)值為97.2%(140/144)。酶活性法診斷女性新生兒G6PD缺乏癥的靈敏度為59.5%(25/42)，特異度為100.0%(103/103)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.0%(25/25)，陰性預(yù)測(cè)值為85.8%(103/120)。酶活性法與Sanger測(cè)序法診斷男性新生兒G6PD缺乏癥的結(jié)果一致性較好(Kappa=0.974，P<0.05)，診斷女性新生兒G6PD缺乏癥的結(jié)果一致性一般(Kappa=0.676，P<0.05)。見(jiàn)表3、4。

表3 酶活性法與Sanger測(cè)序法診斷男性新生兒G6PD缺乏癥的結(jié)果(n)

表4 酶活性法與Sanger測(cè)序法診斷女性新生兒G6PD缺乏癥的結(jié)果(n)

2.5MMCA法與Sanger測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果比較 以Sanger測(cè)序法為G6PD缺乏癥基因診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，對(duì)MMCA法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，MMCA法診斷男性新生兒G6PD缺乏癥的靈敏度為97.0%(164/169)，特異度為100.0%(140/140)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.0%(164/164)，陰性預(yù)測(cè)值96.6%(140/145)。MMCA法診斷女性新生兒G6PD缺乏癥的靈敏度為100.0%(42/42)，特異度為100.0%(103/103)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.0%(42/42)，陰性預(yù)測(cè)值為100.0%(103/103)。MMCA法與Sanger測(cè)序法診斷男性新生兒G6PD缺乏癥的結(jié)果一致性較好(Kappa=0.967，P<0.05)，診斷女性新生兒G6PD缺乏癥的結(jié)果完全吻合(Kappa=1.000，P<0.05)。有5例男性新生兒用MMCA法檢測(cè)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，Sanger測(cè)序法顯示1例為c.585G>T，1例為c.94C>G，1例為c.152C>T，2例為c.1003G>A。見(jiàn)表5、6。

表5 MMCA法與Sanger測(cè)序法診斷男性新生兒G6PD缺乏癥的結(jié)果(n)

表6 MMCA法與Sanger測(cè)序法診斷女性新生兒G6PD缺乏癥的結(jié)果(n)

3 討 論

G6PD缺乏癥是一種X染色體連鎖不完全顯性遺傳的紅細(xì)胞酶缺陷病，男性只有1條X染色體，所以G6PD缺乏癥表型為酶活性明顯降低的半合子；而女性有2條X染色體，所以女性G6PD缺乏癥表型為雜合子或純合子，且大部分女性為雜合子，本研究基因診斷為G6PD缺乏癥的42例女性患兒均為雜合子。女性雜合子患兒的酶活性可表現(xiàn)為正常、輕度缺乏、中度缺乏和顯著缺乏[6]，因此，只篩查酶活性會(huì)漏診表型正常的女性雜合子患兒,G6PD缺乏癥雜合子是新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[7]，所以進(jìn)行基因檢測(cè)對(duì)女性雜合子患兒的篩查很重要。本研究對(duì)454例初篩為G6PD缺乏癥的患兒采用酶活性法與MMCA法分別檢測(cè)G6PD活性與基因突變類(lèi)型，其中基因突變類(lèi)型共檢出15種，c.1388G>A、c.1376G>T和c.95A>G是湘潭地區(qū)最常見(jiàn)的G6PD基因突變類(lèi)型，與湖南省其他地區(qū)的相關(guān)報(bào)道結(jié)果相符[8-9]。本研究檢出了21例酶活性正常，而MMCA法和Sanger測(cè)序法的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的新生兒，包括4例男性新生兒和17例女性新生兒，考慮出現(xiàn)該結(jié)果可能有以下幾個(gè)原因：(1)同義突變未引起氨基酸的改變，突變?yōu)槎鄳B(tài)性位點(diǎn)；(2)新生兒急性溶血期由于新生紅細(xì)胞G6PD活性偏高可能導(dǎo)致酶活性法檢測(cè)結(jié)果偏高；(3)在急性溶血期，由于新生兒血液中幼稚紅細(xì)胞較多，G6PD活性較高；(4)其他未知原因造成的假陰性結(jié)果[10]。詢(xún)問(wèn)21例新生兒的相關(guān)病史，4例男性新生兒有輸血史和黃疸治療史；17例女性新生兒中3例有黃疸治療史，因此女性新生兒只有進(jìn)行G6PD基因檢測(cè)才能提高雜合子的檢出率。

目前，臨床上針對(duì)G6PD缺乏癥的基因檢測(cè)方法有很多種，如等位基因寡核苷酸探針雜交、變性梯度凝膠電泳、錯(cuò)配堿基PCR/限制性?xún)?nèi)切酶圖譜分析、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、DNA測(cè)序等方法均可用于G6PD基因突變檢測(cè)，但是上述方法成本高，操作過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，通量低，不適合大規(guī)模樣本檢測(cè)。MMCA法的主要原理是根據(jù)DNA序列長(zhǎng)度、GC含量及堿基互補(bǔ)差異，應(yīng)用高分辨率的熔解曲線(xiàn)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行分析，其極高的分辨精度可達(dá)到對(duì)單一堿基差異的分析。本研究中首先采用酶活性法和MMCA法對(duì)454例初篩陽(yáng)性的G6PD缺乏癥患兒分別進(jìn)行酶活性和基因檢測(cè)，再以Sanger測(cè)序法的檢測(cè)結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，評(píng)價(jià)酶活性法和MMCA法的檢測(cè)效能。對(duì)男性新生兒而言，酶活性法檢測(cè)的靈敏度為97.6%，特異度為100.0%，與Sanger測(cè)序法的檢測(cè)結(jié)果一致性較好；MMCA法檢測(cè)的靈敏度為97.0%，特異度為100.0%，與Sanger測(cè)序法的檢測(cè)結(jié)果一致性較好。表明用酶活性法和MMCA法診斷男性新生兒G6PD缺乏癥的效能高。對(duì)女性新生兒而言，酶活性法檢測(cè)的靈敏度為59.5%，特異度為100.0%，與Sanger測(cè)序法的檢測(cè)結(jié)果一致性一般；MMCA法檢測(cè)的靈敏度、特異度均為100.0%，與Sanger測(cè)序法的檢測(cè)結(jié)果完全一致，與胡韋維等[11]的相關(guān)研究結(jié)果相同。這也提示女性雜合子難以單純根據(jù)酶活性進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，因?yàn)榇嬖诼┰\風(fēng)險(xiǎn)[12]，因此，建議女性新生兒直接采用MMCA法進(jìn)行檢測(cè)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，與Sanger測(cè)序法的結(jié)果比較，MMCA法有5例假陰性結(jié)果，分析其原因：G6PD基因突變檢測(cè)試劑盒(MMCA法)是根據(jù)目前已報(bào)道的中國(guó)人群G6PD基因突變的等位基因頻率，選擇了16種常見(jiàn)的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物和探針，因此其檢測(cè)范圍與突變位點(diǎn)的位置有關(guān)；而Sanger測(cè)序法是針對(duì)除了第1外顯子以外的所有G6PD基因外顯子進(jìn)行檢測(cè)，其覆蓋范圍比MMCA法更廣。而MMCA法檢測(cè)出的這5例假陰性男性患兒Sanger測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果為c.585G>T(1例)、c.94C>G(1例)、c.152C>T(1例)、c.1003G>A(2例)，由于這些突變類(lèi)型不在MMCA法引物和探針設(shè)計(jì)的檢測(cè)范圍內(nèi)而無(wú)法被檢出。因此，對(duì)臨床高度疑似或者M(jìn)MCA法試劑盒未覆蓋的未知突變標(biāo)本要用Sanger測(cè)序法確診。

與Sanger測(cè)序法相比，MMCA法具有以下優(yōu)點(diǎn)，(1)檢測(cè)快速、高通量：可同時(shí)檢測(cè)46份標(biāo)本，并在2.5 h內(nèi)完成；(2)操作簡(jiǎn)便：PCR與熒光探針雜交在同一反應(yīng)體系內(nèi)實(shí)時(shí)進(jìn)行，不需要PCR擴(kuò)增后的雜交過(guò)程；(3)不易污染：閉管操作，無(wú)需PCR后處理；(4)方法可靠、結(jié)果易判斷：其結(jié)果自動(dòng)判斷，減少人為因素判讀失誤；(5)成本更低[13-14]。

綜上所述，與傳統(tǒng)的酶活性法比較，MMCA法具有靈敏度、特異度高的優(yōu)點(diǎn)，是一種快速、準(zhǔn)確、適用于臨床診斷G6PD缺乏癥的方法。