肺炎克雷伯菌對頭孢他啶/阿維巴坦的耐藥性分析

楊 銘，蘇 博，臺錦閣，汪定成，邵海連，張霄霄，張 倩，董 軻

空軍軍醫大學第二附屬醫院檢驗科，陜西西安 710038

肺炎克雷伯菌是臨床常見的引起嚴重感染的重要病原菌，近年來，其檢出率和耐藥率逐年增高，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)的耐藥率由2013年的4.9%上升至2019年的10.9%，使臨床抗感染治療愈加困難[1-2]。新型抗菌藥物頭孢他啶/阿維巴坦可有效抑制β-內酰胺酶，能用于嚴重革蘭陰性菌感染的治療[3]，這為臨床治療和控制肺炎克雷伯菌，特別是CRKP引起的嚴重感染提供了新的途徑。本研究通過分析肺炎克雷伯菌對頭孢他啶/阿維巴坦的耐藥性，以期為臨床抗感染治療提供實驗依據。現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 選取2018年1月至2020年6月本院檢出的肺炎克雷伯菌1 785株為研究對象。

1.2儀器與試劑 頭孢他啶(30 μg)/阿維巴坦(20 μg)藥敏紙片(英國Oxoid公司)，VITEK MS全自動快速微生物質譜檢測系統(法國生物梅里埃公司)，WalkAway 96 Plus全自動細菌鑒定及藥敏分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)，Thermal cycler型PCR儀(美國ABI公司)，高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，DYY-8C型穩壓穩流定時電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，Mini BIS PRO凝膠成像系統分析儀(以色列DNR公司)。TapDNA聚合酶(日本TaKaRa公司)，瓊脂糖(美國Invitrogen公司)，胰蛋白胨、酵母浸出物(英國Oxoid公司)，DL2000 DNA Marker、溴化乙錠(北京鼎國生物技術有限公司)。PCR擴增引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，其余試劑為實驗室自行配制。

1.3方法

1.3.1藥敏試驗 采用WalkAway 96 Plus全自動細菌鑒定及藥敏分析儀檢測1 785株肺炎克雷伯菌對21種抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC) 。對CRKP補充頭孢他啶/阿維巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環素及多黏菌素B的藥敏試驗，結果根據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI) 2020版相關標準進行判斷。

1.3.2改良碳青霉烯類滅活法(mCIM)和乙二胺四乙酸碳青霉烯類滅活法(eCIM) 對CRKP進行檢測，取A、B兩支含2 mL胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)的試管，B管加入20 μL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液混勻，再向A、B管中分別加入1 μL已在血平板上孵育18～24 h的待檢細菌，震蕩混勻10～15 s。A、B管中分別放入1張含10 μg美羅培南的無菌紙片，確認紙片浸沒于菌懸液中，35 ℃ 4 h孵育；孵育結束后，用接種環分別將A、B管中的美羅培南紙片取出，貼于同一塊已涂布有0.5麥氏濁度大腸埃希菌ATCC 25922的MH瓊脂平板上。根據CLSI 2020相關標準進行結果判斷。

1.3.3碳青霉烯酶抑制增強試驗 將0.5麥氏濁度的CRKP菌懸液均勻涂布于MH瓊脂平板上，貼4張亞胺培南紙片，1張紙片不滴加任何液體，1張紙片滴加10 μL氨基乙基二苯硼酸酯(APB)溶液，1張紙片滴加10 μL EDTA溶液(初始濃度0.1 mol/L)，1張紙片同時滴加APB溶液和EDTA溶液各10 μL。過夜孵育，量取抑菌圈直徑。結果判讀如下：如滴加APB溶液使抑菌圈直徑擴大5 mm以上，判斷為產A類碳青霉烯酶；如滴加EDTA溶液使抑菌圈直徑擴大5 mm以上，判斷為產B類碳青霉烯酶；如同時滴加APB和EDTA溶液使抑菌圈直徑擴大5 mm以上，則判斷為同時產A類和B類碳青霉烯酶。

1.3.4碳青霉烯酶耐藥基因檢測 對2020年1-6月收集的19株CRKP進行碳青霉烯酶耐藥基因檢測，參考文獻[4-5]設計引物。PCR反應體系為20 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 10 μL，引物1 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水8 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性 3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環; 最后再72 ℃延伸4 min。擴增產物送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，序列經BLAST數據庫進行比對分析。

1.4統計學處理 采用Excel 2010進行數據分析。

2 結 果

2.1菌株分布 1 785株肺炎克雷伯菌分離自痰液的占63.47%，分離自血液的占10.25%，分離自尿液的占9.36%，其他來源占16.92%；檢出率位于前9位的科室依次為腦外科(25.77%)、神經內科(12.83%)、呼吸科(10.14%)、胸外科(6.61%)、重癥監護室(6.55%)、血液科(4.87%)、骨科(4.08%)、普外科(2.91%)、中醫科(2.24%)。121株CRKP主要分離自重癥監護室。

2.2藥敏試驗結果 1 785株肺炎克雷伯菌對頭孢他啶/阿維巴坦的敏感率為95.49%，藥敏試驗結果見表1。121株CRKP對頭孢他啶/阿維巴坦的敏感率為80.17%，藥敏試驗結果見表2。

表1 1 785株肺炎克雷伯菌藥敏試驗結果(%)

表2 121株CRKP對補充抗菌藥物的藥敏試驗結果(%)

2.3mCIM及eCIM檢測結果 對121株CRKP進行mCIM及eCIM檢測，其中101株mCIM陽性，占83.5%(101/121)，產碳青霉烯酶；101株mCIM陽性菌株中，22株eCIM陽性，占21.8%(22/101)，產金屬β-內酰胺酶。

2.4碳青霉烯酶抑制增強試驗結果 對121株CRKP進行碳青霉烯酶抑制增強試驗，78株產絲氨酸酶，占64.5%；22株產金屬β-內酰胺酶，占18.2%；1株同時產絲氨酸酶和金屬β-內酰胺酶(該菌株在mCIM和eCIM聯合檢測時被誤判為僅產絲氨酸酶)，占0.83%。

2.5碳青霉烯酶耐藥基因檢測結果 對19株CRKP進行blaKPC-2、blaIMP、blaVIM、blaGIM、blaSPM、blaNDM-1、blaOXA-48共7種常見碳青霉烯酶耐藥基因的擴增，其中15株檢測出blaKPC-2,3株檢測出blaNDM-1，1株同時檢測出blaNDM-1和blaKPC-2。見圖1。

注：A為部分菌株耐藥基因blaKPC-2的檢測結果，其中1為陽性對照，2～4為臨床菌株；B為耐藥基因blaNDM-1的檢測結果，其中5為陽性對照，6～8為臨床菌株。

3 討 論

近年來，由于廣譜抗菌藥物的廣泛使用，肺炎克雷伯菌耐藥情況日趨嚴峻。肺炎克雷伯菌感染，尤其是CRKP感染的控制和治療成為臨床重點關注的問題。肺炎克雷伯菌的耐藥機制主要包括產超廣譜β-內酰胺酶、碳青霉烯酶、頭孢菌素酶(AmpC)，膜孔蛋白缺失或突變，外排泵過度表達等。肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類耐藥最常見的原因是產碳青霉烯酶[6]。Ambler分類法將碳青霉烯酶分為A、B、D 3類,A類酶包括KPC、GES、IMI、SME和SFC，其活性部位含有絲氨酸結構，屬于絲氨酸酶，部分可被克拉維酸抑制；B類酶包括NDM、VIM、SPM、GIM、SIM和IMP，其活性部位含有鋅離子，屬于金屬酶，能被EDTA抑制；D類酶主要包括OXA-48。阿維巴坦可抑制A類和某些D類碳青霉烯酶。

本研究中，CRKP對頭孢他啶/阿維巴坦的耐藥率為19.83%，對頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率為93.07%，該結果與國內同類研究類似[7]；而CRKP對米諾環素的耐藥率為15.64%，低于同類研究[7]。本研究對121株CRKP進行了mCIM和eCIM檢測，產碳青霉烯酶菌株檢出率為83.5%，其中產金屬β-內酰胺酶菌株占21.8%，該結果比其他研究產碳青霉烯酶菌株的檢出率(44.83%)高[8]，可能與地區差異和菌株流行差異有關。1株同時產絲氨酸酶和金屬β-內酰胺酶的CRKP在mCIM和eCIM聯合檢測時被誤判為僅產絲氨酸酶，而在碳青霉烯酶抑制增強試驗中，該菌株被準確檢測出了上述兩種酶。碳青霉烯酶抑制增強試驗能夠準確檢測酶型，但除了A類酶和B類酶以外，其不能有效區分是否產碳青霉烯酶，還是僅為碳青霉烯酶和/或AmpC酶合并膜孔蛋白的下調或缺失。提示mCIM、eCIM和碳青霉烯酶抑制增強試驗聯合使用可能能更準確地檢測出D類酶[9]。本研究檢測出2種碳青霉烯酶基因blaPKC-2和blaNDM-1，未檢測出blaIMP、blaVIM、blaOXA-48等基因型和變異，可能與檢測的樣本量較少有關[10]。

肺炎克雷伯菌對頭孢他啶/阿維巴坦敏感，CRKP導致的嚴重感染也可使用頭孢他啶/阿維巴坦治療。藥敏試驗和碳青霉烯酶耐藥基因鑒定對合理使用抗菌藥物具有重要意義。