某院肺炎克雷伯菌分布及其耐藥性與攜帶毒力基因種數的關系

吳 乾

江蘇省常州市中醫醫院檢驗科，江蘇常州 213000

肺炎克雷伯菌是醫院感染常見的病原菌之一，主要分布在上呼吸道、腸道等部位，當機體抵抗力下降時其可經上呼吸道進入到肺內導致肺實質病變，引起大葉性肺炎或小葉性肺炎[1-2]。近年來，臨床上抗菌藥物的大量應用導致人體呼吸道菌群改變，肺炎克雷伯菌的耐藥性逐年升高。2015年全國細菌耐藥監測報告顯示，肺炎克雷伯菌對頭孢菌素和碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率分別為36.5%、7.6%[3]。但是不同地區肺炎克雷伯菌的分布和耐藥性存在差異，因此，本研究探討了本院肺炎克雷伯菌的分布情況及其耐藥性與攜帶毒力基因種數的關系，以期為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1菌株來源 選擇2017年1月至2020年1月本院分離的肺炎克雷伯菌190株為研究對象，同一患者同類型標本分離到的同一菌株不重復計入。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2菌株鑒定和藥敏試驗 分離出的菌株使用美國BD公司生產的Phoenix 100全自動細菌鑒定儀進行鑒定。使用美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)2014年發布的相關標準進行結果判讀，使用抗菌藥物體外敏感的藥敏紙片進行頭孢唑啉、頭孢噻肟、復方磺胺甲噁唑、慶大霉素、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢吡肟、哌拉西林、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、環丙沙星、阿米卡星及亞胺培南的藥敏試驗。

1.3毒力基因檢測 首先制備DNA模板，采用水煮法，99 ℃煮10 min，然后以12 000 r/min離心5 min，收集上清液作為PCR模板。PCR反應體系：2.5 μL 10×PCR緩沖液,上下游引物各0.5 μL,2.0 μL DNA基因組模板,1.0 μL Tap聚合酶，采用ddH2O定容至25.0 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。aer-1、rmpA、magA、ybt、gyrB-2及wcaG基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，擴增試劑由日本Takara公司提供,使用PCR檢測上述基因。

1.4統計學處理 采用WHONET5.6分析藥敏試驗結果，采用SPSS18.0進行數據分析。計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman相關。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1肺炎克雷伯菌的分布情況 190株肺炎克雷伯菌中，來自男性患者112株，女性患者78株；患者年齡13～77歲，平均(45.2±6.9)歲。來自呼吸系統感染患者133株(70.00%)，消化系統感染患者17株(8.95%)，腫瘤患者40株(21.05%)。99株(52.11%)來自痰液標本，53株(27.89%)來自膿腫穿刺液或膿性分泌物標本，16株(8.42%)來自腹水標本，10株(5.26%)來自血液標本，12株(6.32%)來自尿液標本。

2.2肺炎克雷伯菌的耐藥性 190株肺炎克雷伯菌中，有46株(24.21%)為產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)菌株，144株(75.79%)為非產ESBLs菌株。肺炎克雷伯菌對哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢呋辛、頭孢曲松的耐藥率較高，分別為43.68%、37.89%、32.63%、33.68%、32.63%，對頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率較低，分別為6.84%、4.21%、1.58%、11.05%。肺炎克雷伯菌產ESBLs菌株對頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢呋辛、頭孢曲松、哌拉西林的耐藥率達100.00%，見表1。

表1 肺炎克雷伯菌的耐藥率分布[n(%)]

2.3肺炎克雷伯菌的毒力基因分布情況 毒力基因aer-1、rmpA、magA、ybt、gyrB-2、wcaG的檢出率分別為54.74%、48.95%、15.79%、53.16%、51.58%、21.05%。肺炎克雷伯菌產ESBLs菌株和非產ESBLs菌株的毒力基因檢出率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。攜帶1種毒力基因的菌株占24.74%，攜帶6種毒力基因的菌株占13.16%，肺炎克雷伯菌毒力基因攜帶情況見表3。

表2 肺炎克雷伯菌的毒力基因分布情況[n(%)]

表3 肺炎克雷伯菌的毒力基因攜帶情況(n=190)

2.4毒力基因與耐藥性間的關系 分析肺炎克雷伯菌攜帶毒力基因種數(“0～6”分別表示菌株檢出0～6種毒力基因)與耐藥藥物種數(“0～15”分別表示對0～15種藥物耐藥)的相關性，結果顯示，攜帶毒力基因種數與耐藥藥物種數呈負相關(r=-0.869，P<0.05)。

3 討 論

肺炎克雷伯菌是呼吸道感染常見的病原菌之一，有較高的多重耐藥和交叉耐藥性，是導致患者住院時間延長、病死率增高的重要原因[4-6]，因此,研究肺炎克雷伯菌的分布特點及其耐藥性對臨床診治工作具有重要的指導意義。

本研究分離出的190株肺炎克雷伯菌中，來自呼吸系統感染患者的占70.00%；來自痰液標本的占52.11%，提示肺炎克雷伯菌主要引起呼吸道感染，對呼吸道感染患者進行痰液標本檢測十分必要。此外，本研究從腹水標本中分離出16株(8.42%)肺炎克雷伯菌，從血液標本中分離出10株(5.26%)肺炎克雷伯菌，提示肺炎克雷伯菌還可能導致血流感染及腹腔感染，雖然檢出率不高，但臨床也應重視對腹水、血液標本的檢測。

本研究中，產ESBLs菌株的檢出率為24.21%。肺炎克雷伯菌的多重耐藥可能與產ESBLs有關[7]。產ESBLs是肺炎克雷伯菌對β-內酰胺酶類抗菌藥物多重耐藥的重要機制，ESBLs不僅可以分解第1、2、3代頭孢菌素及廣譜青霉素，還可分解第4代頭孢菌素，對喹諾酮類、氨基糖苷類發生交叉耐藥[8]。本研究發現，肺炎克雷伯菌對哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢呋辛、頭孢曲松的耐藥率較高，分別為43.68%、37.89%、32.63%、33.68%、32.63%，對亞胺培南的耐藥率最低，為1.58%，說明肺炎克雷伯菌對哌拉西林和頭孢菌素類抗菌藥物有較高的耐藥性，對碳青霉烯類抗菌藥物亞胺培南的耐藥性較低，主要是因為碳青霉烯類抗菌藥物是一種廣譜抗菌藥物，對頭孢菌素酶或ESBLs的作用較穩定，有持續抗菌后效應，是治療革蘭陰性菌感染的一線藥物，但是有研究表明隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應用，其耐藥性也在不斷增加[8]。此外，本研究分離的肺炎克雷伯菌對頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星的耐藥率也較低，分別為6.84%、4.21%。建議臨床在選用抗菌藥物時盡量根據藥敏試驗結果進行選擇，避免大量使用碳青霉烯類抗菌藥物，以免造成抗菌藥物濫用及多重耐藥菌的產生。

肺炎克雷伯菌含有一些毒力基因，可以編碼一些蛋白質，參與肺炎克雷伯菌的侵襲、定植、黏附及抗吞噬等過程[7]。本研究結果顯示，肺炎克雷伯菌毒力基因aer-1、rmpA、magA、ybt、gyrB-2、wcaG的檢出率分別為54.74%、48.95%、15.79%、53.16%、51.58%、21.05%，并且產ESBLs菌株和非產ESBLs菌株的毒力基因檢出率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。magA可以編碼一種外膜蛋白，該蛋白與肺炎克雷伯菌形成莢膜多糖有關，并且magA表達可引起轉移性膿毒癥、原發性肝膿腫等[9]。rmpA表達可以控制類黏蛋白表型和莢膜黏多糖的產生，與肺炎克雷伯菌的抗吞噬作用有較大關系。ybt表達可使肺炎克雷伯菌在呼吸道定植，并且可降低脂質運載蛋白2水平，導致肺炎[10-11]。在本研究中，肺炎克雷伯菌毒力基因的檢出率較高，且存在攜帶多種毒力基因的情況。肺炎克雷伯菌的致病性與毒力、耐藥性有關[12]，本研究發現，肺炎克雷伯菌攜帶毒力基因種數與耐藥藥物種數呈負相關(r=-0.869，P<0.05)，說明攜帶毒力基因種數越多的菌株，耐藥藥物的種數越少，即發生多重耐藥性的概率越小。

綜上所述，肺炎克雷伯菌主要引起呼吸道感染，對頭孢菌素類、哌拉西林等抗菌藥物的耐藥率較高。肺炎克雷伯菌中毒力基因aer-1、rmpA、ybt、gyrB-2的檢出率較高，且攜帶毒力基因種數越多，對抗菌藥物可能越敏感。