營養脅迫對豹皮樟扦插苗葉片光合生理特性的影響

曾維軍，屈坤杰，李 鵬，萬 誠，席培宇，王濟紅*

(1.貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009；2.上海市巖土地質研究院有限公司，上海 200072)

豹皮樟(LitseacoreanaLevl.var.sinensis)是樟科、木姜子屬朝鮮木姜子的變種，常綠喬木，零星分布于貴州、四川、重慶、安徽、廣東和云南等亞熱帶地區，生長于海拔900 m以下山地雜木林中。豹皮樟根、葉入藥，全年可采。其嫩葉是西南地區傳統茶飲老鷹茶的主要原料，具消暑解渴，消食祛脹，降血糖、降血脂等功效[1，2]。礦質營養對茶樹的生理生化影響顯著，其中氮、磷、鉀、鈣、鐵是大多數植物生長發育過程中不可缺少的營養元素。如缺鉀的茶樹生物量、葉片鉀含量、葉綠素含量、葉片CO2同化速率、氣孔導度、水分利用率等都顯著下降，而胞間CO2濃度會顯著升高[3]；Ca2+是細胞內重要的第二信使，其介導的信號轉導可緩解逆境脅迫對植物的傷害[4]；鎂是葉綠素的組成成分，葉綠素a和葉綠素b中都含有鎂，對植物的光合作用、碳水化合物的代謝和呼吸作用具有重要意義[5]。但豹皮樟作為老鷹茶的原料，其生理生化特性與眾多茶樹具有差異，其光合生理特性直接影響著葉片有機物的積累，不同營養元素又參加了其生理代謝過程，所以研究營養脅迫對豹皮樟扦插苗葉片光合生理特性的影響具有重要意義，同時也可以為豹皮樟科學合理補充礦質營養達到提質增效的效果提供理論依據。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料及試驗地概況

試驗材料為貴州省生物研究所與貴州省湄潭縣恒源農牧有限公司在貴州省湄潭縣茶產業現代農業園區共同培育的豹皮樟3年生扦插苗，平均株高(25±2)cm、基徑粗(3±0.5)mm。用口徑×高為15 cm×20 cm塑料盆栽植，栽培基質為蛭石，每盆裝基質1.0 kg，定植1株。

將材料種植在貴州省湄潭縣興隆鎮丁家溝村試驗大棚中，溫度為自然變溫，大棚遮蔭率為50.0%。材料種植地屬亞熱帶濕潤季風氣候，夏季溫暖濕潤，冬季干燥寒冷，年平均氣溫14.9 ℃，最冷月(1月)平均氣溫3.8 ℃，最熱月(7月)平均氣溫25.1 ℃，無霜期平均284 d，年日照時數1163 h，年總輻射量3488 MJ·m2。

1.2 試驗設計

按照霍格蘭氏營養液配方配制儲備液與營養液。共設置7個處理：完全營養液、缺N、缺P、缺K、缺Ca、缺Mg、缺Fe、CK(清水)；每種處理30株，3次重復，隨機排列。定植后30 d開始噴施處理，間隔7 d噴施1次，每次每株用量20 mL，連續噴施處理15次。定植后所有處理基質相對含水量保持在30.0%左右，澆水需在噴施營養液3 d日后進行。

1.3 儀器設備

帶紅藍光源的Li-6400光合測定儀(LI-COR，美國)、UV-1800SPC雙光束紫外分光光度計(Macy，中國)、Primovert顯微鏡(ZEISS，德國)、電鏡掃描、NX50冷凍切片機(Thermo Fisher Scientific，美國)。

1.4 測定的方法

1.4.1 光合日變化的測定 6月5日，晴天天氣，從8∶00到18∶00每隔1 h選定相同營養脅迫處理下3株豹皮樟扦插苗頂枝的1片成熟葉，使用Li-6400光合測定儀測量其凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、細胞間隙二氧化碳濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)，同時記錄光合有效輻射(PAR)、周圍大氣二氧化碳濃度(Ca)、空氣溫度(T)及相對濕度(RH)。

1.4.2 光合作用氣體交換參數的測定 在Li-6400光合測定儀上安裝紅藍光源，以豹皮樟扦插苗的光響應曲線的凈光合速率最大值對應光強1000 μmol/(m2·s)為設定光強，選擇晴天9∶30～11∶30，使用CO2注入系統，穩定CO2濃度在400 mol/(m2·s)；選擇長勢良好的植株，隨機選取完全伸展、無病蟲害和無機械損傷葉片為對象，重復測定3株，每片葉重復記錄3個觀測值。系統自動記錄Pn(凈光合速率)、Gs(氣孔導度)、Ci(細胞間CO2濃度)、Tr(蒸騰速率)。計算Ls(氣孔限制值)、WUE(葉片水分利用率)，Ls=1-Ci/Ca，WUE=Pn/Tr。

1.4.3 光合特性理化指標的測定 葉綠素含量的測定采用丙酮法；過氧化物酶POD活力的測定采用愈創木酚法；過氧化氫酶CAT活力的測定采用碘量滴定法；超氧化物歧化酶SOD活力的測定采用氯化硝基四氮唑光化還原法。

1.4.4 葉片橫切面顯微觀察 使用NX50冷凍切片機對豹皮樟扦插苗葉片進行切片。不同處理選取頂端成熟葉片橫切面制片，葉片橫切面使用Primovert顯微鏡進行觀察，每組內每張切片隨機挑選5個200倍視野進行拍照。應用Image-Pro Plus 6.0軟件以200倍標尺為標準，選取10處測量每張片子的上表皮厚度(mm)、下表皮厚度(mm)，測量出柵欄組織和海綿組織的厚度(mm)、密度(每個視野中柵欄組織和海綿組織的個數)。

1.5 數據處理

采用SPSS 26.0統計分析軟件進行數據統計和方差分析，采用S-N-K法進行方差檢驗，用Graphpad Prism 9作圖。

2 結果與分析

2.1 不同營養脅迫下豹皮樟扦插苗葉片凈光合速率日變化參數比較

如表1所示，缺素處理下豹皮樟扦插苗葉片光合日變化曲線類型有改變，缺P處理的“光合午休時間”最長，為4 h；缺K、缺Ca的最短，為1 h；缺Ca的日凈光合速率最大值和均值與其他處理相比較高，完全營養下的較小；缺N的凈光合速率日變化變異系數最低，為14.55%，缺Ca的次之，為17.68%，完全營養下凈光合速率日變化變異系數最高，為34.61%。

2.2 不同營養脅迫下豹皮樟扦插苗葉片光合作用氣體交換參數差異分析

在不同營養脅迫處理下，缺Ca的豹皮樟扦插苗葉片的凈光合速率均值為6.17 μmol/(m2·s)，顯著大于其他處理。缺N和缺K的葉片氣孔導度均值分別為0.084、0.099 mol/(m2·s)，顯著高于其他處理，此兩者間差異不顯著，但是缺K的氣孔導度測量參數離散程度較高；缺P和缺Mg的氣孔導度比其他處理顯著降低；但和完全營養下的相比差異不顯著。CK、缺N和缺K的胞間CO2濃度差異不顯著，均顯著高于其他處理；缺P的胞間CO2濃度為112.56 μmol/mol，顯著低于其他處理。缺K和缺Ca的葉片的蒸騰速率相當，均顯著高于其他處理，但缺K的蒸騰速率測量值參數離散度較大；缺P的和完全營養下的蒸騰速率相當，顯著低于其他處理。葉片的氣孔限制值以缺P的最高，缺K的最低。完全營養和缺P下的葉片水分利用率相差不顯著，但顯著高于CK；缺N和缺K的葉片水分利用率相差不顯著，顯著低于CK(圖1)。

圖1 不同營養脅迫下豹皮樟扦插苗葉片光合作用氣體交換參數的差異

2.3 不同營養脅迫下豹皮樟扦插苗的葉片面積、總葉綠素含量差異分析

在各種缺素處理和完全營養下的豹皮樟扦插苗的葉面積均顯著低于CK，其中缺K和缺Ca的葉面積分別為8.16、7.73 cm2，兩者差異不顯著，但均顯著低于其他處理；CK和缺K的葉片總葉綠素含量最高，完全營養和缺Mg的最低(圖2)。

圖2 不同營養脅迫下豹皮樟扦插苗葉片面積、總葉綠素含量的差異

2.4 不同營養脅迫下豹皮樟扦插苗葉片橫切組織結構差異分析

在完全營養、缺P、缺Ca、缺Mg處理下的豹皮樟扦插苗的葉片上表皮厚度都顯著低于CK，其中缺Mg的最低；缺N和缺Fe的葉片下表皮厚度顯著高于CK；CK的柵欄組織厚度最低，缺Ca的葉片柵欄組織厚度顯著高于其他處理；缺N時，葉片海綿組織厚度最高，CK和缺Ca的海綿組織厚度差異不顯著，但都顯著低于其他處理；各營養脅迫處理下的豹皮樟扦插苗葉片柵欄組織密度差異不顯著，海綿組織密度差異顯著，其中缺N的海綿組織密度顯著高于CK及其他處理(圖3、圖4)。

A～H分別是CK、完全營養液、缺N、缺P、缺K、缺Ca、缺Mg、缺Fe下豹皮樟扦插苗葉片橫切面組織顯微結構。

圖4 不同營養脅迫下豹皮樟扦插苗葉片橫切組織結構量化參數

2.5 不同營養脅迫下豹皮樟扦插苗葉片光合作用相關酶類活性分析

如圖5所示，缺N的豹皮樟扦插苗葉片POD活性顯著高于其他處理，CK和缺Mg的POD活性顯著降低；缺素處理下的葉片CAT活性均顯著低于完全營養和CK，其中CK顯著低于完全營養下的；完全營養和缺N下的PPO活性顯著增高，缺Ca的顯著降低。

圖5 不同營養脅迫下豹皮樟扦插苗葉片光合作用相關酶類活性的差異性分析

3 討論與結論

在缺氮條件下，葉片CO2同化速率、氣孔導度都顯著下降，胞間CO2濃度顯著增加，但是缺氮后的表現在不同品種間存在一定的差異[3]。本研究發現，在缺氮條件下豹皮樟扦插苗葉片的氣孔導度顯著高于對照，胞間CO2濃度則與CK無顯著差異，缺磷和缺鎂的葉片氣孔導度、胞間CO2濃度顯著低于對照，缺氮下的氣孔導度、過氧化物酶及多酚氧化酶活性顯著高于對照。光合植物中多酚氧化酶定位于葉綠體類囊體膜上，由此推測多酚氧化酶可能與豹皮樟的光合作用有關，多酚氧化酶可能對其光合作用進行反向調節，并參與構成電子傳遞鏈和能量轉換。

缺磷茶樹葉片的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性降低[6]，其中過氧化氫酶活性降低和本試驗豹皮樟扦插苗葉片過氧化氫酶活性顯著低于對照的結果相似；同時本研究還發現，缺磷下的過氧化物酶和多酚氧化酶活性是顯著高于對照的，這兩個酶反映植物的抗性，說明缺磷下豹皮樟會通過自身生理調節來提高抗逆性。

在缺鉀條件下茶樹的葉綠素含量、葉片CO2同化速率、氣孔導度、水分利用率等都顯著下降，而胞間CO2濃度會顯著升高[3]。缺鉀葉片還通過增加熱耗散以保護葉片在強光下免遭光氧化傷害[7]。但是在本研究中，缺鉀的豹皮樟扦插苗的葉綠素總量、氣孔導度與對照相比并沒有顯著下降，凈光合速率與胞間CO2濃度無顯著變化；缺鉀下豹皮樟扦插苗葉面積、葉片上表皮厚度下降，說明缺鉀顯著影響著葉片的生長發育；葉片中過氧化氫酶、多酚氧化酶活性下降，說明抗逆性減弱；缺鉀下豹皮樟葉片蒸騰速率的增加可以增加熱耗散以保護葉片在強光下免遭光氧化傷害，這和部分學者的研究結果相似。

鈣是植物生長發育所必需的營養元素，在維持細胞膜磷脂及膜結合蛋白的穩定性中起重要作用[8]。本研究發現缺鈣的豹皮樟的凈光合速率最大值、蒸騰速率、柵欄組織厚度均顯著高于對照。在自然生長條件下，Rubisco的活化、RuBP的再生是完整的葉片以較佳狀態進行光合作用的兩個重要代謝步驟，主要發生在葉片的柵欄組織和海綿組織細胞內[9]，所以缺鈣時豹皮樟扦插苗一是通過增加葉片柵欄組織的厚度，增加光合生化反應場所來促進光合生理代謝；二是提高葉片的蒸騰速率來應對環境改變。

鎂是葉綠素環形結構的主要組成元素，是磷酸轉移許多酶必需的元素。在本研究中，缺鎂沒有顯著改變豹皮樟的凈光合速率，但是葉綠素總量，以及過氧化氫酶、過氧化物酶、多酚氧化酶活性均低于對照，說明豹皮樟缺鎂，影響葉綠素合成及磷酸轉移，從而會影響其光合作用和呼吸作用。

鐵和細胞色素合成有關，缺鐵會導致植物葉片缺綠現象，從而降低光合作用[10]。在本研究中，缺鐵下的豹皮樟光合日變化中凈光合速率均值較低，但凈光合速率和葉綠素總量與對照差異不顯著。

總之，氮、磷、鉀、鈣、鎂、鐵營養脅迫對豹皮樟扦插苗的光合日變化、氣體交換參數、葉面積、葉綠素、葉片組織結構及抗逆性酶類都有影響，但各不相同，從而改變著豹皮樟扦插苗的光合生理特性。