甲狀腺激素受體β基因對β淀粉樣蛋白42誘導的小膠質細胞炎癥和細胞凋亡作用機制

康 濤,朱利娟,曹冰清,薛延莉,楊 謙

(1.陜西省人民醫院神經內科，陜西 西安710068；2陜西省人民醫院麻醉科，陜西 西安710068)

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性疾病[1]。臨床上AD的特點是大量的淀粉樣蛋白刺激神經元和突觸，誘發神經炎癥，最終導致記憶喪失。β淀粉樣蛋白(Amyloid-β，Aβ)在大腦中的大量積累被認為是AD發展的重要標志，Aβ沉積在AD的發病機制中起著決定性的作用[2]，靶向Aβ斑塊的示蹤劑已被用于影像學臨床應用及研究[3]。

甲狀腺激素受體β基因(Thrb)對神經發育起著重要的調控作用。同時，Thrb在聽覺和視覺功能中起著重要作用，是影響脊椎動物神經系統發育的關鍵介質[4]。目前，關于Thrb對AD作用的研究報道較少，因此有必要對其在AD中的作用及作用機制進行進一步探究。

Sirt3(Sirtuin 3)是哺乳動物Sirtuin家族的成員，是一種依賴于NAD的組蛋白去乙酰化酶，主要存在于線粒體中[5-6]。有報道稱，Sirt3通過調節靶蛋白(包括能量代謝介質和線粒體氧化還原應激蛋白)調節線粒體內穩態[7]。近年來，人們發現Sirt3在Aβ誘導的AD中起著重要作用[8]。Salvatori等[9]報道稱，Sirt3的降低與AD患者的線粒體功能障礙有關，Sirt3的表達隨著AD的進展而降低。本試驗旨在探究Thrb對Aβ42誘導的小膠質細胞氧化應激和凋亡的作用以及作用機制，從而為臨床上老年癡呆癥的治療提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 小膠質細胞BV2購自中國科學院昆明動物研究所；RPMI1640培養基、胎牛血清購自美國HyClone公司；Trizol、反轉錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative Real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒購自美國Promega公司；BCA蛋白質定量檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；兔抗鼠Thrb、兔抗鼠caspase-3、兔抗鼠caspase-9、兔抗鼠Sirt3、兔抗鼠FOX3a和鼠抗GAPDH購自美國Abcam公司；轉染試劑LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；PCR引物、pcDNA3.1-Thrb、si-Sirt3和si-FOX3a由北京擎科生物科技有限公司設計、合成；二氧化碳培養箱購自上海力申科學儀器有限公司；PCR儀和iMark酶標儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：小膠質細胞BV2用含有10%胎牛血清的DMEM細胞培養液，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2.2 細胞轉染：pcDNA3.1-Thrb以及si-Sirt3和si-FOX3均由北京擎科生物科技有限公司設計、合成。根據Thrb的序列，設計合成PCR引物，擴增Thrb基因全長，連接于線性化的過表達載體pcDNA3.1(+)上，形成可表達Thrb的同源重組質粒(pcDNA3.1-Thrb)。將細胞分為未處理組(Untreated)、空白對照組(Control)、陰性對照組(pcDNA3.1)、Thrb過表達組(pcDNA3.1-Thrb)及si-Sirt3和si-FOX3a。按照Lipofectamine 3000?說明書將pcDNA3.1-Thrb及si-Sirt3和si-FOX3a按照以上分組轉染至BV2細胞中，置于37 ℃、5% CO2條件下繼續培養。孵育48 h后檢測轉染效率，實驗設置3個重復。

1.2.3 細胞增殖:將BV2細胞以1×105個/孔的密度接種于96孔板中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h；向培養板中加入不同濃度(5、10、20、40、80、160 μg/ml)的WST-8，于37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養24 h；每孔加入20 μl CCK溶液，孵育24 h；酶標儀測定450 nm處的OD值。

1.2.4 細胞凋亡率的測定:對于細胞凋亡檢測，收獲轉染pcDNA3.1-Thrb和對照質粒pcDNA3.1 48 h后的細胞，離心，并重懸于結合緩沖液中。然后，異硫氰酸熒光素(FITC)和PE-Texas Red溶液連續染色細胞，使用FACSCalibur TM流式細胞儀進行分析。

1.2.5 炎癥因子的測定:按照相應的ELISA試劑盒說明檢測BV2細胞中的一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)的濃度。具體操作如下：準備試劑、樣品；加入準備好的樣品，37 ℃孵育30 min；洗板5次，加入酶標試劑，37 ℃孵育30 min；洗板5次，加入顯色液A、B，37 ℃顯色10 min；加入終止液，讀OD值。

1.2.6 活性氧(ROS)的測定：將BV2細胞以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h；收集細胞，在37 ℃下用活性氧指示劑DCFH-DA(10 μmd/L)在PBS中培養30 min。使用流式細胞儀(BD Biosciences，CA)分析熒光。

1.2.7 RT-PCR:將BV2細胞以1×105個/孔的密度接種于12孔板，培養24 h后吸去上清液，收集細胞， Trizol法提取胃癌細胞株總RNA，進行反轉錄合成cDNA。qRT-PCR檢測Thrb基因的mRNA表達。引物序列如下，Thrb正向序列：5’-ACGTAACGCTACTGGGACGTT-3’，反向序列：5’-AGTTAGGACGTATACGACAGG-3’；β-actin正向序列：5’-CTCACCATGGATGATGATATCGC-3’，反向序列：5’-AGGAATCCTTCTGACCACTGC-3’。以2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。β-actin為內參。

1.2.8 Western blot:消化對數生長期的BV2細胞，接種于25 cm2培養瓶中，細胞融合至80%～90%時進行細胞轉染。48 h后收集各組細胞，收集細胞上清液，并消化下貼壁細胞，加RIPA裂解液于冰上裂解10 min，4 ℃、12000 r/min離心30 min(離心半徑9.5 cm)。上清液用BCA蛋白質定量檢測試劑盒測定蛋白含量后，取30 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，130 V恒壓電泳2 h；濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上；室溫下以含5%脫脂奶粉的Tris緩沖液粉筆PVDF膜1 h，裁剪后分別與一抗孵育，4 ℃過夜；TBST清洗膜8 min，重復4次，加相應的HRP標記的二抗，室溫孵育2 h；TBST重復清洗膜4次，ECL試劑盒檢測蛋白表達，以GAPDH作為內參。

2 結 果

2.1 Aβ42顯著抑制Thrb表達且具有劑量依賴性 RT-PCR和Western blot檢測BV2細胞經不同濃度(50、100 ng/ml)的Aβ42誘導后Thrb的表達量。結果顯示，BV2經Aβ42誘導后Thrb的mRNA和蛋白的表達量均顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05，圖1A﹑B)。

A：Thrb在Aβ42誘導后的BV2細胞中的mRNA表達量；B：Thrb在Aβ42誘導后的BV2細胞中的蛋白表達量。

2.2 過表達Thrb緩解Aβ42誘導小膠質細胞BV2的細胞凋亡 為了驗證Thrb在小膠質細胞BV2中的功能，我們在BV2細胞中分別轉染pcDNA3.1-Thrb和對照質粒pcDNA3.1，后經濃度為100 ng/ml的Aβ42處理。經Aβ42處理后，細胞活力顯著降低，而轉染pcDNA3.1-Thrb則顯著提高細胞活力(均P<0.05，圖2A)；與Control組相比，pcDNA3.1-Thrb顯著降低細胞凋亡率(P<0.05，圖2B)；同樣的，pcDNA3.1-Thrb抑制了caspase-3和caspase-9的表達量(均P<0.05，圖2C)。由此說明過表達Thrb緩解了Aβ42誘導的小膠質細胞BV2的細胞凋亡。

A：過表達Thrb對細胞活力的影響；B：過表達Thrb對細胞凋亡的影響；C：過表達Thrb對caspase-3和caspase-9表達量的影響。與 Untreated組比較，*P<0.05；與Control組比較，#P<0.05

2.3 過表達Thrb緩解Aβ42誘導小膠質細胞BV2的炎癥和氧化應激 如圖3所示，細胞經Aβ42處理后，促炎因子IL-6、TNF-α和NO的水平均顯著升高，而pcDNA3.1-Thrb則顯著降低上述促炎因子的水平(均P<0.05，圖3A-C)；此外，與Control組相比，pcDNA3.1-Thrb顯著降低細胞中ROS的含量(P<0.05，圖3D)；pcDNA3.1-Thrb提高了細胞中NAD+和ATP的水平(均P<0.05，圖3E、F)。由此說明過表達Thrb緩解了Aβ42誘導的小膠質細胞BV2的炎癥反應和氧化應激。

2.4 過表達Thrb促進Sirt3和FOX3a表達及sh-Thrb抑制Sirt3和FOX3a的表達 如圖4所示，過表達Thrb顯著促進Sirt3和FOX3a的表達(均P<0.05，圖4A)；與此相反，當干擾Thrb的表達時，Sirt3和FOX3a的表達量均顯著降低(P<0.05，圖4B)；此外，細胞經Aβ42誘導后Sirt3和FOX3a的蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05，圖4C)。

2.5 Sirt3/FOX3a參與Thrb對Aβ42誘導細胞損傷的保護機制 為了進一步探究Thrb對小膠質細胞BV2作用的分子機制，我們在BV2細胞中分別轉染sh-Sirt3或sh-FOX3a或pcDNA3.1-Thrb，檢測不同處理組細胞中細胞凋亡和炎癥因子以及ROS的含量。結果顯示，sh-Sirt3或sh-FOX3a均顯著抑制細胞活力(P<0.05，圖5A)；此外，sh-Sirt3或sh-FOX3a均促進細胞凋亡(P<0.05，圖5B)；進一步研究發現，sh-Sirt3或sh-FOX3a顯著提高了細胞中IL-6的水平(均P<0.05，圖5C)；pcDNA3.1-Thrb降低了細胞中自由ROS的含量。然而sh-Sirt3或sh-FOX3a提高了細胞中ROS的水平，逆轉了pcDNA3.1-Thrb的抑制作用(均P<0.05，圖5D)。以上結果說明Sirt3/FOX3a參與了Thrb對Aβ42誘導的細胞損傷的保護機制。

A：過表達Thrb對細胞中IL-6水平的影響；B：過表達Thrb對細胞中TNF-α水平的影響；C：過表達Thrb對細胞中NO水平的影響；D：過表達Thrb對細胞中ROS含量的影響；E：過表達Thrb對細胞中ATP水平的影響；F：過表達Thrb對細胞中NAD+水平的影響。與Untreated組比較，*P<0.05；與Control組比較，#P<0.05

A：過表達Thrb對Sirt3和FOX3a的表達量的影響；B：sh-Thrb對Sirt3和FOX3a表達量的影響；C：Aβ42誘導對Sirt3和FOX3a表達量的影響。與Control或Untreated組比較，*P<0.05；與pcDNA3.1或sh-RNA或50 ng/ml組比較，#P<0.05

3 討 論

AD是最常見的老年病之一，占70歲以上老年癡呆發病率的60%～70%[10]。Aβ在腦內的積聚被認為是AD發生發展的一個重要事件[11]。Aβ是一種含有39～43個氨基酸的多肽，由分泌酶水解β淀粉樣前體蛋白產生，最常見的亞型是Aβ40和Aβ42[12]。Aβ42毒性更強，易于聚集并引起神經毒性[13]。Aβ42的神經毒性作用在AD的進展中起重要作用[14]。據報道，大鼠或猴大腦皮質注射Aβ42后，注射部位出現組織壞死、外周神經細胞丟失、角蛋白增生，且與劑量呈顯著相關性[15]。

Thrb在組織分化、生長發育、保持代謝平衡及調節甲狀腺激素作用等方面具有重要作用[16]。此外，Thrb對神經發育起著重要的調控作用，是影響脊椎動物神經系統發育的關鍵介質[17]。Ng等[18]研究發現Thrb的缺失引起小鼠和人的耳聾和甲亢，并導致甲狀腺激素抵抗綜合征，提示Thrb與神經系統和感覺系統密切相關。本研究發現，Thrb可減輕Aβ42誘導的BV2功能障礙。有趣的是，Thrb能夠直接與Sirt3結合，通過調節Sirt3的表達來減輕AD的癥狀。

A：sh-Sirt3或sh-FOX3a對細胞活力的影響；B：sh-Sirt3或sh-FOX3a對細胞凋亡的影響；C：sh-Sirt3或sh-FOX3a對細胞中IL-6水平的影響；D：sh-Sirt3或sh-FOX3a對細胞中ROS含量的影響。與未處理組比較，*P<0.05；與pcDNA3.1-Thrb組比較，#P<0.05；與pcDNA3.1-Thrb+sh-RNA組比較，$P<0.05

Sirt3主要定位于線粒體，參與多種生物學過程[19]。此外，Sirt3增強線粒體抗氧化谷胱甘肽的表達，減緩動物衰老[20]。眾所周知，氧化應激誘導的線粒體功能障礙是AD早期最重要的特征，包括線粒體呼吸酶活性降低、代謝功能障礙等[21-22]。Li等[23]發現在原代海馬神經元和AβO處理的動物模型中，HKL可以通過增強Sirt3的活性來調節線粒體功能，包括增加三磷酸腺苷水平和減少活性氧的產生。先前的研究報道，Sirt3廣泛參與調節阿爾茨海默病，并在其發展過程中發揮重要作用[24]。Salvatori等[9]報道稱，Sirt3的降低與AD患者的線粒體功能障礙有關，Sirt3的表達隨著AD的進展而降低。

在本研究發現，Aβ42顯著抑制Thrb表達且具有劑量依賴性；過表達Thrb顯著降低Aβ42誘導的小膠質細胞BV2的細胞凋亡率和炎癥因子的水平，并顯著緩解Aβ42誘導的小膠質細胞BV2的氧化應激；進一步的研究結果表明，Thrb顯著促進Sirt3和FOX3a的表達且Sirt3/FOX3a參與了Thrb對Aβ42誘導的細胞損傷的保護機制。由以上結果說明Thrb能夠緩解小膠質細胞BV2氧化應激和凋亡，降低細胞損傷，其作用機制是通過調控Sirt3/FOX3a信號通路來實現的。

綜上所述，本研究證明Thrb顯著降低Aβ42誘導的小膠質細胞BV2的細胞凋亡率，并顯著緩解細胞氧化應激，其作用機制是通過調控Sirt3/FOX3a信號通路來實現的，這一結果能夠為阿爾茲海默癥的臨床治療和診斷提供分子基礎。