羥基磷灰石/殼聚糖復合微球的制備及其表征

洪杰，盧雅明，龔春華，賁永光

（1.華南理工大學校醫院，廣東廣州 510641；2.廣東藥科大學藥學院，廣東廣州 510006）

羥基磷灰石（hydroxyapatite,HAP）是脊椎動物骨骼和牙齒等硬組織中廣泛存在的無機成分，具有良好的生物相容性和生物活性，無毒無刺激，有望成為理想的脊椎動物硬組織的口腔醫學材料，在口腔醫學應用領域具有相當廣闊的應用前景[1-3]。迄今為止，文獻報道了多種制備HAP的方法。相比于其他方法，超聲化學法由于其高效、綠色環保的特點引起了人們的廣泛關注[3-4]。殼聚糖（chitosan，CS）是一種具有良好的生物相容性、可生物降解的天然堿性多糖，且具有一定黏性，能改善HAP材料本身脆性較大、強度小的問題［5-6]。兩者結合的HAP/CS復合材料性能優異，在生物醫學研究領域受到了廣泛關注，但多數研究主要集中在藥物載體和骨組織工程方面［1,7-8]，應用在口腔臨床上的研究鮮見報道。

本文采用超聲輔助化學沉淀法、反相乳化交聯法制備分散性良好的納米HAP和HAP/CS復合微球，并采用傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）、X線粉末衍射法（XRD）、掃描電鏡（SEM）進行表征，為進一步開發應用在牙齒抗菌和填充等方面的制劑提供理論依據。

1 儀器與材料

FA2004型電子天平（上海舜宇恒科學儀器有限公司）；KQ-600DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（上海鷹迪儀器設備有限公司）；TDL-60B型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；LX0211型馬弗爐（天津市波特瑞儀器設備有限公司）；UV-5500PC型紫外-可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；Empyrean型X線粉末衍射儀（德國Bruker公司）；FT/IR-480·Plus型傅里葉變換紅外光譜儀（日本Jasco公司）；Merlin型場發射掃描電鏡（德國蔡司公司）。

Ca（NO3）2·4H2O（海麥克林生化科技有限公司）；（NH4）2HPO4（天津市大茂化學試劑廠）；無水乙醇（天津市致遠化學試劑有限公司）；殼聚糖（上海麥克林生化科技有限公司）；其余均為分析純。

2 方法

2.1 羥基磷灰石（HAP）的制備及表征

采用超聲輔助化學沉淀法，在控制Ca（NO3）2·4H2O和（NH4）2HPO4的Ca/P摩爾比值為1.67的條件下制備納米羥基磷灰石。稱取7.080 g Ca（NO3）2·4H2O、2.381 g（NH4）2HPO4放入燒杯中，分別溶解在60 mL去離子水中，配制成0.5 mol/L的Ca（NO3）2溶液和0.3 mol/L的（NH4）2HPO4溶液，2種溶液均用氨水調節pH值至10[9]。在40℃、600 r/min的磁力攪拌條件下，用分液漏斗將（NH4）2HPO4溶液恒速逐滴加入Ca（NO3）2溶液中，反應1 h。反應結束后，將溶液轉至超聲器皿，超聲分散45 min，陳化24 h。將溶液倒出，在轉速為2 000 r/min下離心1 min，倒掉上層清液，用去離子水和無水乙醇各洗滌3次。將沉淀物在80℃烘干，研磨，馬弗爐700℃煅燒2 h，即得HAP粉體，采用FTIR、XRD及SEM對其結晶結構及組成進行分析。

2.2 不同質量比的HAP/CS復合微球的制備及表征

采用反相乳化交聯法制備HAP/CS復合微球，考察不同質量比的HAP∶CS對HAP/CS復合微球形貌的單因素影響。將25 mL液狀石蠟（含體積分數為3%司盤-80）倒入燒杯內，燒杯置于恒溫機械攪拌水浴鍋中，溫度設為50℃，攪拌混勻[10-11]。稱取CS粉末0.15 g，充分溶解于5 mL體積分數為2%的冰乙酸水溶液中，分別加入不同質量的羥基磷灰石粉末（HAP∶CS的質量比為70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70），攪拌超聲混合后逐滴加入燒杯內。在一定的速度下磁力攪拌1 h后，得到白色乳液。然后緩慢加入25%戊二醛0.6 mL，繼續攪拌1 h后進行交聯固化。將黃褐色反應液倒出，在轉速2 000 r/min下離心1 min后，倒掉上層液體，再依次用異丙醇、石油醚、無水乙醇各洗滌3次。將黃褐色沉淀放入烘箱中60℃烘干，即得HAP/CS復合微球，采用FTIR、XRD及SEM對HAP/CS復合微球進行表征。

3 結果與分析

3.1 FTIR表征結果

3.1.1 HAP的FTIR表征結果

由圖1可知，474、571、601 cm-1是P-O的彎曲振動吸收峰，而出現在1 040、1 090 cm-1的強譜帶和962 cm-1吸收峰是P-O的伸縮振動吸收峰，由這2處吸收峰可初步判定樣品中含有PO43-，證實HAP經過馬弗爐高溫煅燒后結晶性較強。875、1 387、1 457 cm-1是CO32-振動吸收峰，其中1 387 cm-1和1 457 cm-1處出現的雙峰，是CO32-進入磷灰石結構的重要標志，可以說明HAP粉體中PO43-結構固溶有部分CO32-結構，CO32-的存在是由于粉體在合成、陳化過程中吸收了空氣中少量的CO2。3 571 cm-1處是O-H的對稱伸縮振動產生的，1 651 cm-1處是水分子的彎曲振動吸收峰。以上結果表明：制備的樣品中含有和OH-，證明合成了羥基磷灰石。

圖1 HAP的FTIR光譜圖Figure 1 FTIR spectrum of HAP

3.1.2 CS的FTIR表征結果

由圖2可知，3 540 cm-1是OH-1和?NH2伸縮振動的重疊峰，1 663、1 567、1 322 cm-1是酰胺Ⅰ譜帶特征峰（即C=O的伸縮振動），酰胺Ⅱ譜帶特征峰（?NH2變形振動吸收峰）和酰胺Ⅲ譜帶特征峰[12]，1 377 cm-1是酰胺Ⅲ譜帶和?CH2搖晃振動吸收峰，C?O不對稱的伸縮振動吸收峰在1 153、1 420 cm-1是?CH2變形振動和?CH3彎曲振動的吸收峰，1 072、1 032 cm-1處是C?O的對稱伸縮振動吸收峰。

圖2 CS的FTIR光譜圖Figure 2 FTIR spectrum of CS

3.1.3 HAP/CS復合微球的FTIR表征結果

從圖3可知，3 571 cm-1處吸收峰表明HAP的O-H特征峰仍然存在，且在復合后峰的強度變大，原本CS中1 663 cm-1酰胺Ⅰ譜帶特征峰發生紅移至1 671 cm-1、且強度增強。?C?O的不對稱伸縮振動吸收峰從1 153 cm-1藍移至1 089 cm-1，而對稱伸縮振動吸收峰在1 072 cm-1與1 032 cm-1發生藍移且合并為1個移動峰1 045 cm-1，強度有所增強。結果顯示，HAP和CS結合成復合微球后發生相互作用，HAP/CS復合微球與HAP、CS的一些特征吸收峰發生重合[8]且沒有其他雜質峰出現，證明合成了結構穩定的HAP/CS復合微球。

圖3 HAP/CS復合微球的FTIR光譜Figure 3 FTIR spectrum of HAP/CS composite microspheres

3.2 XRD表征結果

根據JCPDS標準卡片PDF-09-0432進行XRD衍射標準譜分析，進一步研究HAP/CS復合微球的成分和結晶性。由圖4（A）可知，HAP產物在2θ為25.9°、31.7°、32.2°、32.8°、39.7°、46.7°、49.4°、53.1°處出現了羥基磷灰石的幾個特征衍射峰，分別對應于HAP晶體（002）、（211）、（112）、（300）、（310）、（222）、（213）、（004）的晶面特征衍射，與納米羥基磷灰石的標準圖譜基本相同，其中（002）、（211）、（300）為羥基磷灰石的主要衍射峰，峰形明銳，半高寬小，表明結晶性好，衍射峰寬說明得到了粒徑較小的顆粒，表明采用超聲輔助化學沉淀法可以制備出結晶度高的羥基磷灰石。由圖4（B）可知，在2θ為19.8°和20.1°處出現殼聚糖的特征衍射峰。由圖4（C）可知，HAP/CS復合微球的衍射圖譜中出現了HAP和CS特征衍射峰，其中CS的衍射峰強度在復合微球圖譜中弱化了的原因是CS呈無定形狀態，在使用反相乳化交聯法與羥基磷灰石交聯后，HAP鑲嵌在表面或者改變了CS結晶形態，降低了CS的結晶度。對比圖4（A），HAP/CS復合微球的衍射圖譜中HAP的特征衍射峰的峰形仍然比較明顯，但強度明顯減弱，表明復合微球中HAP的結晶性比HAP單體的結晶性低。以上結果顯示，HAP/CS復合微球含有HAP和CS 2種成分，且沒有其他雜質峰出現。

圖4 HAP（A）、CS（B）、HAP/CS復合微球（C）的XRD衍射圖Figure 4 XRD diffraction patterns of HAP(A),CS(B),HAP/CS composite microspheres(C)

3.3 SEM表征結果

3.3.1 HAP的SEM表征結果

從圖5可知，制備的HAP呈類棒狀，顆粒大小在100 nm左右，團聚粘連的現象較少，說明超聲輔助化學沉淀法可以制備出尺寸均勻的HAP。

圖5 HAP的SEM圖譜Figure 5 SEM spectra of HAP

3.3.2 HAP/CS的SEM表征結果

在水浴溫度為50℃、水油相比例為1∶5、乳化劑用量為油相的3%、交聯劑用量為0.6 mL的條件下，探索HAP∶CS不同質量比對HAP/CS復合微球的形貌和分散性的影響，結果見圖6。可見，當HAP∶CS質量比為7∶3時，合成的微球粒徑大小不一，微球都粘連在一起，存在大塊的團聚物，分散性差，微球表面凹凸不平，分散著團聚的HAP；隨著HAP的減少，微球的形貌逐漸變規則，粒徑趨向均勻，當HAP∶CS質量比為5∶5時，復合微球的球形更趨近規整，可以看到表面分散的HAP分散較為均勻，顆粒間較其他質量比微球粘連性下降；當HAP∶CS的質量比為3∶7時，均一性下降，微球圓整度高，但微球表面HAP顆粒較少，且分布不均勻，出現大塊團聚物[13]。原因可能是：由于HAP被吸附包埋在CS內部，HAP含量比CS多的時候，兩者界面鍵合作用力較弱，HAP本身脆、強度差使微球成球性差。當HAP和CS含量達到合適的比例時，CS之間的競爭減少，從而更有利于包裹固化形成形貌、粒徑尺寸均勻的微球；當CS含量比HAP多的時候，HAP本身具有較高表面能，更容易發生團聚，與CS的結合程度較差，形成的復合微球上面分布的HAP含量少且不均勻，HAP本身團聚的時候，CS分子內和分子間氫鍵難以形成，CS結晶度降低，導致復合微球大小不均，而且仍存在著沒有復合上去的HAP。

圖6 不同質量比的HAP/CS復合微球的SEM圖譜Figure 6 SEM spectra of HAP/CS composite microspheres with different mass ratios

4 討論

采用超聲輔助化學沉淀法制備得到的HAP納米，晶體粒徑均勻，有少量團聚，粒徑約為100 nm，屬于較小納米范圍，相比較傳統的化學沉淀法具有推廣意義。殼聚糖具有良好的生物相容性，采用反相乳化交聯法制備HAP/CS復合微球，在控制水油比、反應溫度、乳化劑和交聯劑的用量情況下，改變HAP與CS的質量比，通過FTIR、SEM和XRD表征手段可知能夠制備出大小在十幾微米到一百多微米的HAP/CS復合微球，其中當HAP與CS的質量比為5∶5時，能夠制備出較為均勻且較少雜質的HAP/CS復合微球。本研究的主要目的是探究不同HAP含量對HAP/CS復合微球形貌的影響，因此只采用SEM法觀察形貌和顆粒大小，未對樣品進行其他表征，今后將進行相關的深入研究。

本研究制備的HAP/CS復合微球安全無毒、結構穩定，為進一步探究HAP/CS復合微球在牙齒抗菌和填充等方面的應用提供了理論和實踐基礎，在口腔醫學應用領域具有廣闊的應用前景。