人臍帶間充質干細胞外泌體遞送外源miR-130a-3p抑制人肺癌A549細胞的研究

李錦華，陳丹亮，魯欣，王宇恒，唐震林，袁茵

（1.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院/廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東廣州 510006；2.暨南大學附屬第一醫院婦產科，廣東廣州 510630；3.華南師范大學生命科學學院，廣東廣州 510631）

肺癌是臨床常見惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率近年來呈不斷上升的趨勢。非小細胞肺癌約占所有肺癌病例的80%[1]。手術切除、放化療、分子靶向治療等是目前臨床上治療非小細胞肺癌的主要手段，但都無法避免復發、轉移和耐藥等問題，尚需尋找高效、低毒和個性化的新型肺癌治療方法。研究表明，特定的microRNAs（miRNAs）可作為抑癌基因調節肺癌的發展，是潛在的肺癌治療工具。然而，miRNA易降解、體內穩定性差，因此急需開發有效的miRNA遞送體系，以克服miRNA在肺癌等治療中的應用障礙[2]。

外泌體（exosomes）是由細胞分泌并釋放到胞外環境中的納米級生物囊泡，由脂質雙層膜封閉，內含蛋白質、脂類和各種核酸（miRNA、mRNA、DNA等），是細胞間通訊的重要介質[3]。由于具有天然的物質轉運特性以及生物相容性好、體內半衰期長、可穿過血腦屏障等優勢，外泌體已逐漸成為藥物載體領域的研究熱點[4]。已有研究證實外泌體可將抑癌miRNA導入癌細胞，這提供了一種基于外泌體的miRNA遞送和癌癥治療策略[5-6]，但該策略是否適用于肺癌細胞尚未得到證實。本研究以人非小細胞肺癌細胞株A549為研究對象，用人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）來源的外泌體將對肺癌細胞有抑制作用的外源miR-130a-3p[7]運載至A549細胞，觀察A549細胞增殖、遷移和凋亡的變化。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RPMI 1640培養基、DMEM/F12培養基、胎牛血清（FBS）、胰酶、青-鏈霉素（Gibco公司，美國）；UltraCULTURE通用型無血清培養基（LONZA公司，美國）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司，中國）；CD63、CD81抗體（Abcam公司，美國）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（北京中杉金橋公司，中國）；ECL化學發光檢測試劑盒（Millipore公司，美國）；Exo-Fect外泌體轉染試劑（SBI公司，美國）；TRIzol試劑（Thermo公司，美國）；EvoM-MLV反轉錄試劑盒、SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒（艾科瑞生物工程有限公司，中國）；miR-130a-3p mimic及陰性對照、miR-130a-3p特異性逆轉錄莖環引物和PCR引物（銳博生物，中國）；CO2培養箱（SANYO公司，日本）；H-7650型透射電子顯微鏡（日立公司，日本）；電泳儀、電轉儀、化學發光成像系統（上海天能科技有限公司，中國）；Nano Sight NS300納米粒度分析儀（NanoSight公司，英國）；酶標儀（BIO-RAD公司，美國）；Gallios流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）；LightCycler 480熒光定量PCR儀（Roche公司，美國）。

1.2 細胞培養

人非小細胞肺癌細胞株A549購自中國科學院細胞庫，培養于含體積分數為10%FBS的RPMI 1640培養基中，置37℃、5%（φ）CO2、飽和濕度的細胞培養箱中生長，2~3 d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

人臍帶間充質干細胞（hUC-MSCs）由本室分離、鑒定和凍存[8-10]。復蘇后先培養于含10%FBS的DMEM/F12培養基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中生長，3~4 d傳代1次，取P3-P8代細胞用于實驗。

1.3 外泌體分離

培養hUC-MSCs至約80%匯合，然后將培養基更換為UltraCULTURE通用型無血清培養基，繼續培養48 h，收集培養上清，先進行兩步低速離心（300 r/min，10 min；2 000 r/min，10 min）去除細胞碎片，保留上清液，10 000 r/min高速離心30 min，取上清，100 000 r/min超速離心70 min，棄上清，加入PBS重懸沉淀，再次以100 000 r/min超速離心70 min，棄上清后用PBS重懸外泌體沉淀，-80℃凍存。上述所有離心步驟均在4℃進行。

1.4 外泌體生物學特性鑒定

1.4.1 透射電子顯微鏡觀察形態 取10 μL外泌體懸液滴于銅網上，室溫靜置10 min，待充分吸收后，用3%（w∶v）磷鎢酸鈉溶液室溫負染2 min，用蒸餾水洗滌，白熾燈烘干，置于透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.2 Western blot法鑒定外泌體標志蛋白 使用

BCA試劑盒測定外泌體蛋白濃度，經常規SDSPAGE電泳、轉膜、封閉后，分別與CD63、CD81一抗稀釋液于4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，將膜與HRP標記的二抗稀釋液室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，滴加ECL化學發光試劑，使用Tanon4600化學發光成像系統檢測條帶并拍照。

1.4.3 NTA檢測外泌體濃度和粒徑分布 利用Nano Sight NS300納米粒度分析儀檢測外泌體樣品的顆粒濃度和大小分布。將稀釋后的樣品緩慢注入分析儀的樣品池，避免產生氣泡。將樣品池插入機器，以流動模式進行檢測，捕捉外泌體布朗運動的視頻文件，使用NTA 3.2軟件分析捕獲的數據。

1.5 外泌體轉染及分組

用外泌體轉染試劑Exo-Fect將miR-130a-3p mimic及陰性對照轉染至hUC-MSCs外泌體。用上述經轉染的外泌體處理A549細胞，將細胞隨機分為：①NC-exo組：A549細胞與負載miRNA mimic陰性對照的外泌體（NC-exo）共孵育；②130a-exo組：A549細胞與負載miR-130a-3p mimic的外泌體（130a-exo）共孵育。每組外泌體的用量均為2 μg/1 000個細胞，作用時間為72 h。

1.6 RT-qPCR

采用莖環法RT-qPCR檢測與130a-exo共孵育后A549細胞內miR-130a-3p含量的變化。先用胰酶將細胞消化下來，PBS洗滌細胞（1 000 r/min，5 min）2次，最后棄上清，保留細胞沉淀，以排除上清中未被細胞內吞的外泌體的干擾。用TRIzol試劑抽提細胞沉淀總RNA并測定純度和濃度；取每組總RNA各500 ng，使用EvoM-MLV反轉錄試劑盒和miR-130a-3p特異性莖環引物反轉錄成cDNA；使用SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒和miR-130a-3p特異性qPCR引物，以U6為內參照，進行實時熒光定量PCR檢測。實驗共重復3次，采用2-△△Ct法計算miR-130a-3p的相對水平。

1.7 細胞增殖能力檢測

利用CCK-8比色實驗測定細胞增殖能力。將A549細胞接種于96孔板，每孔2×103個細胞，置于37°C含5% CO2的培養箱中孵育24 h使細胞貼壁，用NC-exo或130a-exo處理細胞。72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 °C繼續孵育4 h，于酶標儀450 nm波長處測各孔吸光度值。

1.8 細胞遷移能力測定

通過Transwell小室培養體系檢測并比較各組A549細胞的體外遷移能力。同上加入NC-exo或130a-exo處理A549細胞，72 h后消化、離心收集各組細胞，加入無血清RPMI1640培養基重懸細胞沉淀，制成密度為1×106個/mL的單細胞懸液，取100 μL加入24孔Transwell培養板的上室，下室加入500 μL含10%FBS的RPMI1640完全培養基，放回CO2培養箱；24 h后，取出上室，先用棉簽輕輕擦掉未穿過聚碳酸酯膜的細胞，再將小室放入甲醇固定15 min，干燥后用伊紅染液染色5 min，PBS洗滌后風干，在顯微鏡下隨機選取5個視野計數穿過膜的細胞。

1.9 細胞凋亡檢測

取NC-exo組和130a-exo組A549細胞各1×105個轉入流式檢測管，用PBS洗滌1次，每管加入85 μL結合緩沖液重懸細胞沉淀，再加10 μL Annexin V-FITC和（或）5 μL PI，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，最后向每管中加400 μL結合緩沖液，用流式細胞儀測定各組細胞的凋亡情況，使用FlowJo軟件處理結果。

1.10 統計學分析

使用GraphPad Prism 8.3.0軟件對實驗數據進行統計分析并作圖。實驗數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間均數比較采用Student'st檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外泌體表征

透射電鏡觀察結果如圖1A所示，從hUC-MSCs培養上清中分離的納米顆粒呈圓盤狀，直徑約100 nm，具有膜結構。Western blot實驗結果如圖1B所示，分離自hUC-MSCs培養上清的納米顆粒表達CD63和CD81這兩種外泌體的特異性標記物。NTA檢測結果如圖1C所示，納米顆粒樣品的濃度為8.86×108個/mL，粒徑分布范圍的峰值為135.5 nm。

圖1 hUC-MSCs來源外泌體的表征Figure 1 Characterization of exosomes derived from hUC-MSCs

2.2 hUC-MSCs外泌體介導的miR-130a-3p攝取對A549細胞增殖的影響

通過RT-qPCR評估A549細胞對外泌體內吞情況的結果如圖2A所示，與NC-exo組比較，130a-exo組miR-130a-3p的含量顯著升高（P<0.01）。通過CCK-8法檢測各組細胞增殖能力的結果如圖2B所示，與NC-exo組比較，130a-exo組A549細胞的增殖能力顯著降低（P<0.01）。

圖2 負載外源miR-130a-3p的hUC-MSCs外泌體對A549細胞miR-130a-3p含量及增殖能力的影響Figure 2 Effect of hUC-MSC exosomes transfected with miR-130a-3p mimic on miR-130a-3p level and cell proliferation of A549 cells

2.3 hUC-MSCs外泌體介導的miR-130a-3p攝取對A549細胞遷移的影響

Transwell小室實驗結果如圖3所示，NC-exo組A549細胞的體外遷移數為54.00±6.56，130a-exo組A549細胞的體外遷移數為32.33±6.51。與NC-exo組相比，130a-exo組肺癌細胞的體外遷移能力明顯下降（P<0.05）。

圖3 負載外源miR-130a-3p的hUC-MSCs外泌體對A549細胞遷移能力的影響Figure 3 Effect of hUC-MSC exosomes transfected with miR-130a-3p mimic on the migration of A549 cells

2.4 hUC-MSCs外泌體介導的miR-130a-3p攝取對A549細胞凋亡的影響

通過流式細胞術檢測的A549細胞凋亡情況如圖4所示，與NC-exo組比較，130a-exo組AnnexinV-FITC+細胞的比例（即早期凋亡率）顯著升高（P<0.05），同時，130a-exo組AnnexinV-FITC+PI+細胞的比例（即晚期凋亡率）亦明顯增加（P<0.01）。

圖4 負載外源miR-130a-3p的hUC-MSCs外泌體對A549細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of hUC-MSC exosomes transfected with miR-130a-3p mimic on the apoptosis of A549 cells

3 討論

目前，腫瘤的治療已進入精準治療時代。以EGFR酪氨酸激酶抑制劑為代表的分子靶向藥物使肺癌晚期患者的緩解率和生存率顯著提高。但與化療相似，分子靶向治療也存在耐藥現象[11]。因此，在基因組學、表觀遺傳學迅猛發展的背景下，繼續從分子水平尋找合適的治療工具和靶點對肺癌的診治至關重要。

miRNAs是一類廣泛存在的單鏈非編碼小分子RNA，通過負調控mRNA的翻譯和穩定性，在基因表達的表觀遺傳調控中發揮著積極作用。大量研究表明，miRNAs與肺癌等腫瘤的發生發展密切相關，發揮著抑癌基因或癌基因的生物學功能，是腫瘤診斷和治療的潛在分子工具[12-13]。miR-130a-3p是一個對肺癌有抑制作用的miRNA分子，該分子在肺癌組織和肺癌細胞株A549中的表達均顯著下調，而過表達則能夠顯著抑制A549細胞的增殖、遷移與侵襲[7]。更多的研究顯示，miR-130a-3p對其他類型的腫瘤，包括前列腺癌、乳腺癌、肝癌的增殖、侵襲和轉移都有抑制作用[14-16]。這提示miR-130a-3p可能發揮著抑癌基因的作用，可被用于肺癌等的基因治療[13]。然而，受其在體內易降解等固有屬性的限制，miRNAs在癌癥等疾病治療中的應用還存在一定障礙，開發有效的miRNA遞送系統是克服上述障礙并將miRNAs成功用于臨床的關鍵[2]。

外泌體是一種天然存在的、可由機體大多數細胞分泌的膜性納米囊泡，在尺寸和功能上類似于人工合成的納米顆粒，優點頗多，已成為靶向藥物和基因遞送載體最有希望的候選物[4]。外泌體可裝載的藥物類型包括小分子化學藥物、蛋白質和肽、核酸藥物等[4,17]。

間充質干細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一類來源廣泛、生物學功能極為豐富的成體干細胞。MSCs旁分泌的外泌體，不僅攜帶大量MSCs源功能蛋白，還具有遞送miRNA、抗癌藥物以及抗炎等特殊功能[5-6]。已有研究表明，人臍帶MSCs來源的外泌體可安全地用于動物模型，并在心臟病和肝病中表現出治療作用[18-20]。因此，MSCs是用于輸送藥物的外泌體的理想來源。

前期研究顯示，人臍帶MSCs的培養上清對肺癌A549細胞的生長及遷移有顯著抑制作用[8]。在此基礎上，本研究進一步從hUC-MSCs的培養上清中分離外泌體，并觀察了裝載外源miR-130a-3p的hUC-MSCs外泌體對肺癌A549細胞惡性生物學行為的影響。本研究結果表明，hUC-MSCs外泌體可將外源miR-130a-3p成功遞送至肺癌細胞，其介導的miR-130a-3p攝取顯著抑制了肺癌A549細胞的增殖、遷移，并可誘導A549細胞凋亡。hUC-MSCs外泌體有望被用作miRNA的一種細胞導入載體，在肺癌治療中發揮作用。