白細(xì)胞介素-35介導(dǎo)p38 MAPK/NF-κB信號(hào)對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷的保護(hù)作用

謝亞玲，劉佳麗，楊麗，陳苗苗

（1.綿陽市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，四川綿陽 621000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，四川瀘州 646000）

急性肺損傷（acute lung injury,ALI）是指由嚴(yán)重感染、外傷等原因引起的肺組織內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和肺間質(zhì)的彌漫性損傷[1-2]。白細(xì)胞介素-35（interleukin-35，IL-35）屬于IL-12家族，是由IL-12 p35亞基和EB病毒誘導(dǎo)基因3（epstein-Barr virus inducible gene 3，Ebi3）亞 基 組 成 的 異 二 聚 體[3]。Ebi3是IL-12 p40同源物，也是EB病毒在B淋巴母細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生的睫狀節(jié)神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子[4]。IL-12 p35是一種糖蛋白，在人類大部分組織中表達(dá)[5]。免疫系統(tǒng)活化的樹突狀細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞中均具有Ebi3表達(dá)和分泌。有研究表明，IL-35主要由Treg細(xì)胞限制性分泌，對(duì)免疫功能發(fā)揮很強(qiáng)的負(fù)向調(diào)控。絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[6]。研究證實(shí)，MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡等生物學(xué)過程，MAPK主要成員為p38 MAPK，可調(diào)節(jié)肺部病變炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡[7-8]。核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與機(jī)體細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化、應(yīng)激及組織損傷等過程中信息傳遞[9]。本研究旨在探討IL-35介導(dǎo)p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)小鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量22～25 g，購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2018-17。小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障環(huán)境中，自由進(jìn)食和飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并進(jìn)行。

1.2 試劑與儀器

小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12購(gòu)于上海文韌生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)于上海中喬新舟生物科技有限公司；空白的pcDNA3.1質(zhì)粒、表達(dá)IL-35的pcDNA3.1質(zhì)粒購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaaa‐haricles,LPS）購(gòu)于上海吉至生化科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；IL-12a/p35、EB病毒誘導(dǎo)蛋白3（Ebi3）和β-actin單克隆抗體購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司；Ebi3、IL-35酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked im‐munosorbent assay,ELISA）試劑盒購(gòu)買自欣博盛生物科技公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin6，IL-6）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin1β,IL-1β）ELISA試劑盒購(gòu)于上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司；髓過氧化物酶（myelo‐peroxidase，MPO）試劑盒購(gòu)于上海廣銳生物科技有限公司；Trizol試劑盒購(gòu)于北京天漠科技開發(fā)有限公司；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞MLE-12接種至含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃充滿5%（φ）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%時(shí)，用PBS清洗2次，胰蛋白酶進(jìn)行消化，離心棄上清，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)Lipofectamine 2000說明書將pcDNA3.1-IL-35（pIL-35）質(zhì)粒或pIL-35-NC質(zhì)粒用轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞。

1.4 小鼠急性肺損傷模型制備及分組[10]

將40只小鼠隨機(jī)分成4組，分別為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pIL-35-NC質(zhì)粒組）、LPS組、LPS+NC組、LPS+pIL-35組，每組10只。除對(duì)照組外，其余組小鼠采用3%（φ）戊巴比妥鈉麻醉小鼠，暴露小鼠氣管后，用注射器緩慢滴加LPS入氣管內(nèi)，豎立起小鼠，旋轉(zhuǎn)，使LPS分布均勻，以水柱隨呼吸上下浮動(dòng)作為插管成功標(biāo)志，即為建模成功。在成功建模后，對(duì)照組給予生理鹽水氣管內(nèi)滴注。LPS+NC組：模型小鼠經(jīng)尾靜脈注射轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC空載質(zhì)粒的MLE-12細(xì)胞。LPS+pIL-35組：模型小鼠經(jīng)尾靜脈注射轉(zhuǎn)染pIL-35質(zhì)粒的MLE-12細(xì)胞。

1.5 肺組織病理變化

取小鼠肺組織，使用4%（φ）多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，參照HE染色試劑盒及TUNEL染色試劑盒說明書的步驟進(jìn)行染色5～15 min，常規(guī)清洗、脫水、封片，置于光學(xué)顯微鏡觀察肺部組織學(xué)改變，顯微鏡下隨機(jī)選擇3～5個(gè)視野，于100倍拍照。

1.6 小鼠肺損傷評(píng)分

HE染色后觀察肺組織病理學(xué)變化并行肺損傷評(píng)分，觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡出血、肺水腫、肺泡間隔增寬或透明膜形成4項(xiàng)指標(biāo)，根據(jù)肺損傷嚴(yán)重程度分別進(jìn)行評(píng)分（0分：無病變；1分：輕度病變；2分：中度病變；3分：重度病變；4分：極重度病變），累計(jì)總分為小鼠肺損傷評(píng)分。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)

將肺組織樣本攪碎勻漿，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)為cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR。PCR引物如下：IL-12a/p35（上 游：5′-CCTTGCACTTCTGAAGAGATTGA-3′，下游：5′-ACAGGGCCATCATAAAAGAGGT-3′）；Ebi3（上游：5′-CAGAGCACATCATCAAGCC-3′，下游：5′-GAGAAGATCTCTGGGAAGGG-3′）；β-action設(shè)置為內(nèi)參（上游：5′-GCAAGAGCACAAGAGG A AGA-3′，下游：5′-ACTGTGAGGAGGGGAGATTC-3′）。采用2-??Ct計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8 肺臟組織樣本采集與處理

采集小鼠肺組織，用PBS沖洗干凈，右肺中葉稱濕質(zhì)量（wet weight,W），然后在干燥箱中以80℃烘48 h，測(cè)定干質(zhì)量（dryweight,D），以W/D評(píng)估肺組織的水腫程度。按照試劑盒說明方法進(jìn)行測(cè)定MPO。

1.9 血清TNF-α、IL-6和IL-1β的檢測(cè)

處死小鼠取血清，采用TNF-α、IL-6和IL-1βELISA試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，詳細(xì)步驟遵照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.10 肺組織TNF-α、IL-6和IL-1β檢測(cè)

取小鼠肺臟組織，加入預(yù)冷裂解液行研磨勻漿，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后取上清，?20℃冷藏，采用ELISA法檢測(cè)肺臟組織TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

1.11 Western blot檢測(cè)

取小鼠肺臟組織，將組織剪碎后加入RIPA強(qiáng)裂解液裂解，經(jīng)過離心后測(cè)定上清液蛋白濃度。收集好蛋白樣后進(jìn)行凝膠電泳，過夜孵育一抗后，室溫孵育熒光二抗1 h，用電化學(xué)發(fā)光法（ECL）于暗室發(fā)光。采用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；兩組組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pIL-35預(yù)處理后對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠IL-35表達(dá)的影響

對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無病理表現(xiàn)；LPS組出現(xiàn)肺泡腔變窄，細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞浸潤(rùn)在炎性環(huán)境等ALI病理表現(xiàn)。與對(duì)照組相比，LPS組IL-12a/p35和Ebi3相對(duì)mRNA表達(dá)量降低（P<0.05）。與LPS+NC組 相 比，LPS+pIL-35組IL-12a/p35和Ebi3相對(duì)mRNA表達(dá)量明顯升高（P<0.05）；LPS組和LPS+NC組IL-12a/p35、Ebi3相對(duì)mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，LPS組IL-12a/p35、Ebi3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P<0.05）。與LPS+NC組相比，LPS+pIL-35組IL-12a/p35、Ebi3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加（P<0.05）。LPS組和LPS+NC組IL-12a/p35、Ebi3蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 pIL-35預(yù)處理后對(duì)ALI小鼠IL-35表達(dá)的影響Figure 1 Effect of pIL-35 pretreatment on the expression of IL-35 in ALI mice

2.2 各組小鼠肺臟組織病理觀察及肺損傷評(píng)分

對(duì)照組肺臟組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無病理性損傷；LPS組小鼠肺臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁增寬增厚，肺間質(zhì)出現(xiàn)水腫，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；LPS+pIL-35組肺組織結(jié)構(gòu)較清晰，肺泡壁較模型組更薄，接近對(duì)照組。與對(duì)照組相比，LPS組小鼠肺組織損傷評(píng)分升高（P<0.05）；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠肺組織損傷評(píng)分明顯下降（P<0.05）。與對(duì)照組相比，LPS組小鼠肺組織W/D增大（P<0.05），出現(xiàn)肺水腫；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠肺組織W/D明顯減小（P<0.05）。與對(duì)照組相比，LPS組MPO水平升高（P<0.05）；與LPS組相比，LPS+pIL-35組MPO水平降低（P<0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠肺臟組織病理觀察Figure 2 Pathological observation of lung tissues of mice in each group

2.3 pIL-35預(yù)處理后對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠炎癥因子水平比較

與對(duì)照組相比，LPS組小鼠血清炎癥因子TNFα、IL-6和IL-1β水平升高（P<0.05）；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯下降（P<0.05）。與對(duì)照組相比，LPS組小鼠肺組織炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高（P<0.05）；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠肺組織炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯下降（P<0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠炎癥因子水平Figure 3 Levels of inflammatory factors in mice in each group

2.4 pIL-35預(yù)處理后對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織凋亡的影響

與對(duì)照組相比，LPS組小鼠肺組織凋亡細(xì)胞比例明顯增高（P<0.05）；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠肺組織凋亡細(xì)胞比例明顯降低（P<0.05）。與對(duì)照組相比，LPS組Bax和cleaved cas3/cas3蛋白表達(dá)水平明顯增加，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯減小（P<0.05）；與LPS組相比，LPS+pIL-35組Bax和cleaved cas3/cas3蛋白表達(dá)水平明顯減少，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯增加（P<0.05）。見圖4。

圖4 pIL-35預(yù)處理后對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織凋亡的影響Figure 4 Effect of pIL-35 pretreatment on lung tissue apoptosis in mice with LPS-induced ALI

2.5 pIL-35預(yù)處理后對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路的影響

與對(duì)照組相比，LPS組小鼠肺組織p-p38/p38、p-p65/p65、p-IκB/IκB蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠肺組織p-p38/p38、p-p65/p65、p-IκB/IκB蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.05）；而各組間p38、p65、IκB蛋白表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖5。

圖5 pIL-35預(yù)處理后對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路的影響Figure 5 Effect of pIL-35 pretreatment on p38 MAPK/NF-κB pathway in mice with LPS-induced ALI

3 討論

ALI是造成患者死亡的原因之一，主要的臨床表現(xiàn)是呼吸衰竭和頑固性低氧血癥[11-12]。ALI常見的發(fā)病機(jī)制是炎性細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥，可導(dǎo)致肺泡腔滲出液體，使肺微血管通透性增高，進(jìn)一步導(dǎo)致非心源性肺水腫，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，威脅患者的生命健康[13-14]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)pIL-35預(yù)處理后，LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺臟組織病理?yè)p傷有所緩解。與對(duì)照組相比，LPS組IL-12a/p35和Ebi3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，經(jīng)pIL-35預(yù)處理后，IL-12a/p35和Ebi3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)顯著提升。與對(duì)照組相比，LPS組小鼠肺組織W/D增大，出現(xiàn)肺水腫；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠肺組織W/D明顯減小，肺水腫癥狀有所緩解。與對(duì)照組相比，LPS組MPO水平升高；與LPS組相比，LPS+pIL-35組MPO水平降低。結(jié)果提示經(jīng)pIL-35預(yù)處理后，緩解了LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷，減低MPO的含量，緩解炎癥反應(yīng)。MPO是一種血紅素蛋白，富含于中性粒細(xì)胞中，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激可釋放MPO到組織液中[15]。MPO能催化氧化氯離子產(chǎn)生次氯酸殺死吞噬細(xì)胞中的微生物，破壞多種靶物質(zhì)，在體內(nèi)炎癥的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[16-17]。有研究報(bào)道顯示，酵母混懸液誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠肺臟MPO活力顯著增強(qiáng)[18]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，LPS組小鼠血清和肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠血清和肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯下降（P<0.05）。結(jié)果提示經(jīng)pIL-35預(yù)處理后，減輕了LPS誘導(dǎo)的ALI炎癥反應(yīng)。炎癥因子的大量釋放是ALI最重要的病理進(jìn)程，在誘導(dǎo)肺損傷過程中發(fā)揮著重要作用。LPS作用于肺組織可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α和IL-1β等炎癥因子。TNF-α可在炎癥反應(yīng)起始階段誘導(dǎo)多種炎性因子大量釋放，觸發(fā)級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重ALI患者機(jī)體炎癥刺激[19]。既往研究[20]表明，IL-6、TNF-α和IL-1β炎癥因子在LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠中含量增加，經(jīng)干預(yù)后其水平下降，這與本文研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，LPS組肺組織凋亡細(xì)胞比例、Bax和cleaved ca/cas3蛋白表達(dá)水平明顯增高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯減小；與LPS組相比，LPS+pIL-35組肺組織凋亡細(xì)胞比例、Bax和cleaved cas3/cas3蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高。結(jié)果提示，經(jīng)pIL-35預(yù)處理后抑制了LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)肺臟器官的作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)和促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS組小鼠肺組織p-p38/p38、p-p65/p65、p-IκB/IκB蛋白表達(dá)明顯升高；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠肺組織p-p38/p38、p-p65/p65、p-IκB/IκB蛋白表達(dá)明顯下降。該結(jié)果提示IL-35調(diào)節(jié)p38 MAPK/NF-κB通路抑制LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷。p38 MAPK對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)和正常免疫有重要影響，參加中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等功能性反應(yīng)，同時(shí)可對(duì)生成的微量干擾素進(jìn)行調(diào)節(jié)以調(diào)控T細(xì)胞分化、凋亡[21]。LPS誘導(dǎo)后肺組織內(nèi)p38 MAPK被激活，參加炎癥反應(yīng)與細(xì)胞應(yīng)激、凋亡等多種生物學(xué)行為[22]。NF-κB為調(diào)控炎癥關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，表達(dá)黏附分子、介導(dǎo)單核細(xì)胞形成細(xì)胞因子等多種生物效應(yīng)。NF-κB可加速釋放炎癥介質(zhì)，刺激細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子加重機(jī)體炎癥反應(yīng)。既往研究［23］表明，澤漆醇提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠ALI具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)控MAPK/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，這與本文結(jié)果類似。

綜上所述，IL-35通過調(diào)控p38 MAPK/NF-κB通路，降低LPS誘導(dǎo)ALI小鼠炎癥反應(yīng)程度，緩解病理?yè)p傷，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)受損肺組織起到保護(hù)作用。