MiR-10b-3p通過靶向結合INHBA抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲

張娜賢，劉柳，李剛，劉琳瑞，李元穎

（南陽市第二人民醫院乳腺腫瘤科，河南南陽 473000）

乳腺癌是女性惡性腫瘤病死率最高的惡性腫瘤。隨著現代生物分子診斷技術的飛速發展，乳腺癌的早期診斷與分子靶向治療已取得了一定成果，但患者術后復發率及晚期患者預后仍不理想[1]。因此，深入分析乳腺癌的發生發展機制，探索新的分子靶點，對于乳腺癌的臨床診治有重要作用。研究顯示，微小RNA（miRNAs）可結合靶基因3’非翻譯區，調控其表達，參與惡性腫瘤的多種病理生理過程，發揮促癌或抑癌作用[2-3]。目前研究證實，miR-10b與乳腺癌[4]、肝癌[5]、結直腸癌[6]等多種惡性腫瘤的增殖、侵襲、轉移密切相關。miR-10b-3p作為miR-10b 3’端臂加工產生的miRNA，Canu等［7］研究顯示，miR-10b-3p可靶向精子相關抗原5，影響乳腺癌細胞的增殖。抑制素β A（INHBA）是性腺分泌的水溶性蛋白，可形成抑制素和激活素，調控機體生殖和發育，與多種惡性腫瘤的發生發展有關[8]。前期經miRWalk在線軟件預測miR-10b-3p靶基因為INHBA，但miR-10b-3p是否可靶向INHBA在乳腺癌中發揮作用尚不清楚。基于此，本研究將結合GEO、TCGA數據庫，分析miR-10b-3p對乳腺癌增殖、遷移及侵襲的影響及其潛在機制，旨在為乳腺癌的臨床診斷和靶向治療提供新的靶點及依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株、動物及質粒來源

MCF-7和MDA-MB-231細胞株購自上海生命科學院細胞和生物化學研究所。16只雌性Balb/c裸鼠，6周齡，體質量18~22 g，購自南陽建興實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK（豫）2018-0005。miR-10b-3p質粒、INHBA質粒來自于優寶公司。

1.2 主要試劑與儀器

miR-10b-3p mimics及其陰性對照、pcDNA-INHBA（美國Ambion）；脂質體2000試劑盒、野生型及突變型INHBA熒光素酶報告基因載體（美國Invitrogen）；PrimeScript RT Reagent Kit逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqqRT-PCR試劑盒（日本TaKaRa）；引物序列由北京閱微基因技術有限公司提供；CCK8試劑盒（日本同仁）；Transwell小室、基質膠（美國BD）；β-actin、INHBA蛋白一抗（美國Cell Signaling Technology）；雙熒光素酶活性檢測試劑盒（北京艾然生物科技有限公司）；CFX96Touch實時熒光定量PCR儀、iMARK酶標儀（美國Bio-Rad）。

1.3 數據集的篩選與分析

下載GEO數據GSE45666乳腺癌相關數據矩陣，分析miR-10b-3p與乳腺癌發生發展關系；下載TCGA_BRCA乳腺癌數據矩陣和臨床信息，以乳腺癌中INHBAmRNA表達水平的四分位數分組，將乳腺癌患者分為INHBA高（1/4）、低（3/4）表達兩組，進行基因富集分析，觀察INHBAmRNA表達水平與乳腺癌惡性臨床表型的關系，利用R survival包分析INHBAmRNA在乳腺癌預后中的作用。

1.4 細胞傳代培養與轉染

將MCF-7、MDA-MB-231細胞于37℃水浴中快速解凍，800 r/min離心5 min，懸浮于含有10%（φ）胎牛血清的DMEM高糖培養基中，置于37℃、5%（φ）CO2條件培養，待細胞密度達80%及以上時，按1∶3比例傳代培養。取生長狀態良好的細胞，參照脂質體2000試劑盒說明書操作，轉染miR-10b-3p、質粒，并用G418篩選并構建穩定過表達miR-10b-3p的乳腺癌細胞系。在穩定過表達miR-10b-3p的乳腺癌細胞中轉染INHBA質粒，記作miR-10b-3p+INHBA組。

1.5 實時熒光定量PCR檢測miR-10b-3p、INHBA mRNA水平

收集轉染后細胞，添加Trizol試劑提取總RNA，選取A260/A280為1.8~2.0樣本，參照PrimeScript RT Reagent Kit逆轉錄試劑盒說明書操作，合成cDNA模板鏈，再經SYBR Premix Ex TaqqRT-PCR試劑盒，進行實時熒光定量PCR擴增。擴增條件為：95℃預變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共38個循環。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算miR-10b-3p、INHBAmRNA相對水平，引物序列見表1。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences of genes

1.6 CCK-8實驗檢測細胞增殖

將轉染后細胞接種于96孔板，分別培養24、48、72、96、120 h后，向各孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養2 h，用酶標儀檢測450 nm下各組細胞吸光度（A值），以A值表示細胞增殖能力。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移

將轉染后細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后，用200 μL移液槍頭垂直于細胞孔板劃痕，觀察0 h和24 h時細胞的遷移情況，計算細胞遷移能力[(0 h劃痕寬度?24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度]。

1.8 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲

預先將基質膠包被Transwell小室上室，取轉染后細胞接種于Transwell小室上室，加入無血清培養基，下室添加含有10%（φ）胎牛血清培養基，正常培養24 h后取出Transwell小室，棄去小室內培養液，輕輕拭去上室內細胞，結晶紫染色10 min，顯微鏡下進行細胞計數，實驗孔侵襲細胞數/對照孔侵襲細胞數表示相對侵襲能力。

1.9 裸鼠荷瘤模型的建立及檢測

將過表達miR-10b-3p的MCF-7細胞調整密度為1×107/mL，于裸鼠第二乳墊下注射0.2 mL，若接種部位出現腫瘤結節，即可認為裸鼠荷瘤模型構建成功。肉眼可見瘤體后，每隔2天測量瘤體體積，14 d時處死裸鼠，剝離瘤體稱質量并測量體積，采用實時熒光定量PCR檢測miR-10b-3p水平。

1.10 雙熒光素酶報告基因檢測miR-10b-3p的靶向基因

經miRWalk在線軟件預測miR-10b-3p靶基因為INHBA，將野生型及突變型INHBA熒光素酶報告基因載體與miR-10b-3p mimics和陰性對照分別轉染MCF-7、MDA-MB-231細胞，參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書操作，檢測各組熒光素酶讀數。

1.11 蛋白印跡檢測INHBA蛋白表達

收集轉染后細胞，添加RIPA裂解液提取總蛋白，測定蛋白濃度后，混入上樣緩沖液，沸水浴蛋白變性10 min，取70 μg變性蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳分離后，再電轉至PVDF膜，置于5%脫脂奶粉中，室溫搖床封閉2 h，再加入1∶1 000稀釋的蛋白一抗，4℃搖床孵育過夜，接著加入1∶8 000稀釋的蛋白二抗工作液，37℃搖床孵育1 h，最后進行ECL化學發光。

1.12 統計學方法

采取統計學軟件SPSS17.0分析處理數據，計量資料以均數±標準差（）表示，兩兩均數比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗；采用受試者工作曲線描述miR-10b-3p、INHBAmRNA對乳腺癌的診斷價值，以曲線下面積（AUC）評價其診斷效能；生存分析采用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-10b-3p在乳腺癌臨床組織中的表達及其意義

如圖1，GEO數據集中，與癌旁對照組織比較，乳腺癌組織中miR-10b-3p水平降低（P<0.05）；miR-10b-3p對乳腺癌具有較高的診斷價值，AUC為0.998，95%CI為0.965~1.000；與臨床分期Ⅰ期比較，Ⅱ~Ⅳ期患者miR-10b-3p水平降低（P<0.05）；與T1~T3期 比 較，T4期 患 者miR-10b-3p水 平 降 低（P<0.05）；與臨床組織病理學分級G1~G2級比較，G3級患者miR-10b-3p水平降低（P<0.05）。

圖1 miR-10b-3p在乳腺癌臨床組織中的表達及其意義Figure 1 Expression and significance of miR-10b-3p in breast cancer tissues

2.2 INHBA mRNA在乳腺癌臨床組織中的表達水平及其意義

如圖2，TCGA數據集中，與癌旁正常組織比較，乳腺癌組織中INHBAmRNA水平升高（P<0.05）；INHBAmRNA水平對乳腺癌具有較高的診斷價 值，AUC為0.935，95%CI為0.920~0.948；不 同TNM分期乳腺癌患者中mRNA水平的比較，差異有統計學意義（P<0.05）；與N0期乳腺癌患者比較，N1期患者INHBAmRNA水平升高（P<0.05）；與預后良好乳腺癌患者比較，預后不良患者INHBAmRNA水平升高（P<0.05）；基因富集分析結果顯示，細胞增殖、細胞遷移、腫瘤浸潤及淋巴結轉移基因集富集在INHBA高表達組；生存期分析顯示，INHBA高表達乳腺癌患者總生存期明顯低于INHBA低表達者（P<0.05）。

圖2 INHBA mRNA在乳腺癌臨床組織中的表達水平及其意義Figure 2 Expression and significance of INHBA mRNA in breast cancer tissues

2.3 過表達miR-10b-3p對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

如圖3，與miR-NC組比較，miR-10b-3p組MCF-7、MDA-MB-231細胞中miR-10b-3p水平上調，細胞增殖能力、遷移率及侵襲能力均降低（P<0.05）。

圖3 過表達miR-10b-3p對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響Figure 3 Effect of miR-10b-3p overexpression on the proliferation，migration and invasion of breast cancer cells

2.4 過表達miR-10b-3p對裸鼠腫瘤生長的影響

結果見圖4，與miR-NC組比較，miR-10b-3p組裸鼠瘤體體積、質量均降低，miR-10b-3p水平升高（P<0.05）。

圖4 過表達miR-10b-3p對裸鼠腫瘤生長的影響Figure 4 Effect of miR-10b-3p overexpression on tumor growth in nude mice

2.5 miR-10b-3p與INHBA的靶向關系

結果見圖5，miR-10b-3p與INHBA3’非編翻譯區存在結合位點，與對照組比較，共轉染miR-10b-3p mimics、野生型INHBA熒光素酶報告基因載體組熒光素酶活性明顯降低（P<0.05）；與miR-NC組比較，miR-10b-3p組INHBAmRNA及蛋白表達明顯降低（P<0.05）。

圖5 miR-10b-3p與INHBA的靶向關系Figure 5 Targeted relationship between miR-10b-3p and INHBA

2.6 miR-10b-3p靶向INHBA對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

如圖6，與miR-10b-3p組比較，miR-10b-3p+INHBA組INHBA蛋白表達上調，細胞增殖能力、遷移率及侵襲能力均增加（P<0.05）

圖6 miR-10b-3p靶向INHBA對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響Figure 6 Effect of miR-10b-3p on the proliferation,migration and invasion of breast cancer cells by targeting INHBA

3 討論

近年來，乳腺癌的發病年齡呈年輕化趨勢，嚴重影響患者生命安全，早期篩查乳腺癌對于改善患者預后尤為關鍵[9]。目前，乳腺癌的臨床篩查仍缺乏血清學特異標記物，miRNAs有望成為乳腺癌的早期診斷分子[10]。miR-10b-3p是miRNAs家族成員之一，Guan等[11]研究結果顯示，CMTM5是TCGA數據庫中肝細胞癌的差異表達基因，miR-10b-3p與CMTM5存在靶向關系，miR-10b-3p過表達可靶向CMTM5促進肝細胞癌的增殖、侵襲和遷移能力。張超等[12]研究發現，miR-10b-3p可促進食管鱗癌細胞的增殖、侵襲和遷移，可能作為食管鱗癌基因治療的潛在靶點。上述結果表明，miR-10b-3p在惡性腫瘤的調控中具有雙重作用，可能介導不同靶基因的表達，在惡性腫瘤中發揮促癌或抑癌的作用。本研究通過分析GSE45666乳腺癌數據集，確定乳腺癌患者腫瘤組織中miR-10b-3p水平顯著低于相應癌旁組織，提示miR-10b-3p可能在乳腺癌發揮抑癌作用。同時，miR-10b-3p對乳腺癌具有較高診斷價值，并在不同臨床分級患者中存在差異表達，進一步表明miR-10b-3p是乳腺癌診斷的潛在生物標志物。

INHBA基因可編碼βA亞基，通過形成抑制素和激活素，參與機體生殖、發育過程的調節[13]。越來越多的研究表明，INHBA在結腸癌[14]、胃癌[15]等惡性腫瘤中過表達，與患者臨床預后相關。Liu等[16]對不同乳腺癌細胞系進行基因表達分析，發現INHBA是良性導管原位癌想侵襲型乳腺癌轉變的關鍵調控因子，可能是潛在的預后指標。茅育蕾等[17]檢測85例乳腺浸潤性導管癌及35例癌旁乳腺組織中INHBA表達，結果顯示，INHBA表達與乳腺浸潤性導管癌患者腫瘤分化程度、淋巴結轉移及KI-67增殖指數密切相關，可能參與乳腺癌的發生發展，可用于患者的預后評估。本研究選取TCGA數據集，發現促癌基因INHBA在乳腺癌芯片癌組織中表達上調，可用于乳腺癌的早期診斷、病情及預后的評估。基因富集分析結果顯示，與細胞增殖、細胞遷移、腫瘤浸潤及淋巴結轉移相關的基因集均明顯富集在INHBA高表達組，進一步證實INHBA作為促癌基因，參與乳腺癌的發生發展。

另外，本研究通過miRWalk在線軟件預測miR-10b-3p靶基因為INHBA，且雙熒光素酶報告基因檢測顯示，miR-10b-3p可特異性與INHBA3’非翻譯區結合，靶向抑制INHBA的表達。構建miR-10b-3p過表達MCF-7和MDA-MB-231細胞系后，細胞增殖、遷移與侵襲能力明顯減弱；同時，過表達miR-10b-3p的成瘤陽性裸鼠，瘤體生長也受到明顯抑制。而INHBA過表達可逆轉miR-10b-3p對乳腺癌細胞的抑制作用，提示乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力受到抑制的原因可能是miR-10b-3p直接靶向抑制INHBA，進而影響其下游基因的表達，誘導乳腺癌細胞產生上述細胞學行為。但乳腺癌的發生發展涉及多基因、多途徑的共同調控，是否還有其他因素仍需要進一步探索研究。

綜上所述，miR-10b-3p可能靶向調控INHBA，抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，這為轉移性乳腺癌的靶向治療提供了新思路，后續將深入分析miR-10b-3p在乳腺癌中的調控機制。