茶皂素對臨床常見致病菌的抗菌活性及作用機制研究

劉靜，謝朋飛，蔡延渠

（1.郴州市第一人民醫院藥學部，湖南郴州 423000；2.廣東藥科大學新藥研發中心，廣東廣州 510006；3.國家中醫藥管理局中藥制劑實驗室（三級），廣東廣州 510006；4.廣東省教育廳現代中藥重點實驗室，廣東廣州 510006）

2009年國務院頒布的《全國油茶產業發展規劃（2009－2020年）》中提出，到2020年，全國茶油產量將達250多萬噸、年產值近千億元[1]。據相關數據統計顯示[2]，2019年我國油茶籽年產量已達262萬噸，以湖南、江西、廣西為主產區。在選取油茶籽進行榨油后，殘余的巨量油茶果殼多作為廢料進行焚燒等處理，造成極大的資源浪費與環境污染。

茶皂素是五環三萜類皂苷化合物，由糖體、酸基等結合而成。茶皂素具有廣泛的功能作用與生物活性[3-6]，如表面活性劑（發泡、乳化等）、溶血作用、抗菌、抗氧化、抗炎、抗高血壓、抗癌、降脂、殺蟲驅蟲等。本課題組前期在研究油茶果殼多糖的過程發現，其提取物在提取、濃縮過程中發泡現象十分明顯，結合相關研究資料[7-8]，推測其茶皂素含量較高，值得進一步的研究。因此，本文擬對油茶果殼中茶皂素進行抗菌活性評價及作用機制的初步分析，為油茶果殼的多元化利用和高附加值轉化進行探索，并進一步明確油茶果殼茶皂素抑殺臨床常見致病菌的可行性，為研發低毒有效的抗菌劑或抗菌增效劑提供基礎資料和科學依據。

1 材料

1.1 菌株

ATCC 1228表皮葡萄球菌（Staphylococcus Epi‐dermidis）、ATCC 6538金黃色葡萄球菌（Staphylococ‐cus aureus）、ATCC 700603肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）、ATCC 49103變形桿菌（Proteus vul‐garis）、ATCC 14028沙門氏菌（Salmonella）、ATCC 9027銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、ATCC 8739大腸桿菌（Escherichia coli）、ATCC 43300福氏痢疾桿菌（Shigella flexneri），均來源于廣東省微生物研究所。

1.2 試藥

茶皂素（質量分數>90.0%），課題組自制；鹽酸環丙沙星粉（USA）；環丙沙星藥敏片（10 μg/片，杭州天和微生物試劑有限公司）；PBS緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；營養肉湯培養基（批號：1094671，廣東環凱微生物科技有限公司）；M-H瓊脂培養基（批號：20200516，青島海博生物技術有限公司）；羅丹明123（上海源葉生物科技有限公司）；堿性磷酸酶（AKP）測試盒（南京建成生物工程有限公司）。

1.3 主要儀器

恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化科技設備有限公司）；DHG-9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；HHS2-4型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；LX-B50L型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（合肥華素醫療設備有限公司）；iMark酶標儀、IQ5型熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司）；RF-5301PC型熒光分光光度計（日本島津公司）。

2 方法

2.1 藥液配制

稱取一定質量的茶皂素粉末于容量瓶中，加入純水定容，配制成質量濃度為50.0 mg/mL的貯備液，再按照對半稀釋法依次稀釋成25.0、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.098、0.049 mg/mL的系列濃度樣品溶液；同法以水溶解環丙沙星粉末，配制成質量濃度為50.0、25.0、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.098、0.049 μg/mL的系列濃度陽性對照溶液，冰箱4℃保存備用。

2.2 菌液制備

將表皮葡萄球菌等菌株于-70℃冰箱中取出，在M-H瓊脂板上劃線，37℃培養20 h，挑取形態良好的單菌落于營養肉湯培養基中37℃培養18~20 h，取出后搖勻，采用比濁管進行比對，調節菌液濃度至0.5個麥氏濁度（1×108CFU/mL），再進一步稀釋至1×106CFU/mL，冰箱4℃貯存備用。

2.3 茶皂素的體外抗菌活性測定

2.3.1 抑菌環直徑測定 參考文獻[9]進行操作。采用K-B紙片法，吸取質量濃度為10.0 mg/mL的茶皂素溶液5 μL于6.0 mm紙片上，烘箱50℃烘干，制成每片含50 μg茶皂素的藥敏片。吸取濃度為1×106CFU/mL的菌液0.1 mL，于M-H瓊脂板上涂布均勻，稍晾干，將茶皂素、環丙沙星藥敏片貼放于菌板上，37℃倒置培養20 h，取出用游標卡尺測量抑菌環直徑。每個樣品平行3份。

2.3.2 MIC及MBC測定 參考文獻[9]進行操作。采用微量稀釋法，吸取“2.1”項下不同濃度茶皂素溶液各100 μL于96孔板中（每排的第1~11孔），再依次加入1×106CFU/mL的菌液100 μL，混勻，使得孔中茶皂素終質量濃度依次為25.0、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.098、0.049、0.024 mg/mL；第12孔加入無菌純水和菌液各100 μL，作為陰性對照。加樣后，將96孔板37℃培養20 h，取出觀察孔中有無細菌生長，判定MIC；同時選擇茶皂素質量濃度為MIC、2MIC、4MIC的菌懸液，分別吸取20μL于M-H瓊脂板上涂勻，37℃培養18～20 h，取出觀察計數，以≤5個菌落數者為MBC。同法測定環丙沙星陽性對照溶液的MIC及MBC。

2.4 茶皂素的抗菌作用機制研究

根據活性評價結果，選取革蘭陽性菌——金黃色葡萄球菌、革蘭陰性菌——福氏痢疾桿菌為代表進行抗菌作用機制的初步研究。實驗主要參考文獻[10-12]操作，并進行適當改變。

2.4.1 茶皂素對致病菌生長特性的影響 設置茶皂素不同質量濃度組（1/2MIC、MIC、2MIC）、空白對照組，茶皂素組中分別加入一定濃度藥液和菌液，使其混合液終質量濃度為1/2MIC、MIC、2MIC；空白對照組中只加入同量的無菌純水和菌液。放入恒溫培養箱中37℃培養，于24 h內每隔2 h取出混合培養液，采用酶標儀測定波長600 nm處的吸光度（A600）值，以時間為橫坐標，A值為縱坐標繪制生長抑制曲線，考察不同濃度茶皂素在不同時間點對不同受試菌株生長的影響。

2.4.2 茶皂素對致病菌細胞壁通透性的影響 設置茶皂素不同濃度組（1/2MIC、MIC、2MIC）、空白對照組，茶皂素組中分別加入一定濃度藥液和菌液，使其混合液終質量濃度為1/2MIC、MIC、2MIC；空白對照組中只加入同量的無菌純水和菌液。放入恒溫培養箱中37℃培養12 h，每隔2 h將混合培養液取出，6 000 r/min低溫離心15 min，取上清液，按照堿性磷酸酶試劑盒說明書上的操作測定AKP活性，考察不同濃度茶皂素對不同受試菌株細胞壁通透性的影響。

2.4.3 茶皂素對致病菌細胞膜電位的影響 設置茶皂素不同濃度組（1/2MIC、MIC、2MIC）、空白對照組，茶皂素組中分別加入一定濃度藥液和菌液，使其混合液終質量濃度為1/2MIC、MIC、2MIC；空白對照組中只加入無菌純水和菌液。放入恒溫培養箱中37℃培養，于0、2、4、6、8 h取出混合培養液，6 000 r/min低溫離心15 min，收集菌體沉淀物，用0.01 mol/L的PBS緩沖液沖洗3次，再加入終質量濃度為2 μg/mL的羅丹明123，放置陰暗處避光反應0.5 h，然后繼續用0.01 mol/L的PBS緩沖液對處理后的菌液沖洗3次，采用熒光分光光度計，在激發波長為480 nm、發射波長為530 nm條件下測定樣品熒光強度，考察不同濃度茶皂素對不同受試菌株細胞膜電位的影響。

2.4.4 茶皂素對致病菌細胞內溶物的影響 設置茶皂素不同濃度組（1/2MIC、MIC、2MIC）、空白對照組，茶皂素組中分別加入一定濃度藥液和菌液，使其混合液終質量濃度為1/2MIC、MIC、2MIC；空白對照組中只加入無菌純水和菌液。放入恒溫培養箱中37℃培養6 h，取出混合培養液，6 000 r/min低溫離心15 min，取上清液，采用酶標儀測定A260值，考察不同濃度茶皂素對不同受試菌株細胞內核酸含量的影響；同時按照BCA試劑盒說明書上的操作測定蛋白質含量，考察不同濃度茶皂素對不同受試菌株細胞內蛋白質含量的影響。

2.5 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，實驗數據以表示，采用方差分析及t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 茶皂素的體外抗菌活性評價

茶皂素對受試菌株的抑菌環直徑范圍為10.86~17.31 mm，MIC值范圍為0.20~1.56 mg/mL，MBC值范圍為0.39~3.13 mg/mL；環丙沙星對受試菌株的抑菌環直徑范圍為23.88~31.56 mm，MIC值范圍為0.78~3.12 μg/mL，MBC值范圍為1.56~6.25 μg/mL，見表1。可知，茶皂素對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌的敏感性最強，其次為變形桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、福氏痢疾桿菌，最弱為肺炎克雷伯菌、大腸桿菌。抑菌環直徑的敏感性高低與MIC值的抑制作用強弱表現出良好的相關性。與抗生素環丙沙星相比，茶皂素對所有受試菌株的抑菌環直徑、MIC、MBC差異均具有統計學意義（P<0.01），表明茶皂素的抗菌作用弱于環丙沙星。

表1 8種致病菌株的體外抑菌活性Table 1 In vitro antibacterial activity of 8 pathogenic strains(n=3)

3.2 茶皂素的抗菌作用機制評價

3.2.1 茶皂素對致病菌的生長抑制曲線 不同濃度茶皂素在不同時間點作用于金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌后的A600值，變化趨勢見圖1。金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌，空白組（水）分別在培養8 h、6 h后開始進入對數生長，1/2MIC、MIC茶皂素組分別在10 h、6 h和20 h、20 h開始呈現對數生長；而2MIC茶皂素組則在24 h內基本不增長。結果顯示，茶皂素在1/2MIC濃度時，對金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌的正常生長繁殖稍有影響，而當濃度增加至MIC、2MIC時，能夠顯著地抑制其生長（P<0.01），抑制作用強弱與藥物濃度及作用時間呈現正相關。

3.2.2 茶皂素對致病菌的細胞壁通透性的影響 不同濃度茶皂素在不同時間點作用于金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌后的培養液中AKP含量，變化趨勢見圖2。對于金黃色葡萄球菌和福氏痢疾桿菌空白組，其胞外的AKP含量均極低，當茶皂素濃度為1/2MIC時，胞外AKP含量略微增加，但差異無統計學意義（P>0.05）；而隨著濃度增加至MIC、2MIC時，2種受試菌株的細胞壁均受到明顯的破壞，因此導致胞外AKP含量均明顯增加（P<0.01）。結果亦顯示，隨著藥物濃度的提高，細胞壁受損程度越大，細菌胞外的AKP含量越多，具正相關。

圖2 不同濃度茶皂素對受試菌株細胞外AKP含量的影響Figure 2 Effects of different concentrations of tea saponin on extracellular AKP content of tested strains

3.2.3 茶皂素對致病菌的細胞膜電位的影響 不同濃度茶皂素在不同時間點作用于金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌后的菌液熒光強度，變化趨勢見圖3。未加入茶皂素前，兩種受試菌菌液的熒光強度均基本保持平衡，隨著時間變化略微上升；加入1/2MIC的茶皂素后，熒光強度稍有下降，但差異無統計學意義（P>0.05）。當增大濃度至MIC、2MIC時，金黃色葡萄球菌的菌液熒光強度在2 h內由354.52 AU、350.86 AU分別快速下降至91.92 AU與73.82 AU，福氏痢疾桿菌的菌液熒光強度在2 h內由394.84 AU、385.81 AU分別快速下降至121.54 AU與76.10 AU，與對照組相比差異均具有統計學意義（P<0.01）。主要是由于細胞膜完整性受到嚴重破壞，引起跨膜電位下降，細胞發生去極化，親脂性陽離子物質羅丹明123從細胞中釋放出來，導致細胞內熒光強度顯著性降低。結果表明茶皂素能夠有效影響菌體細胞的代謝活動，從而破壞其正常生長繁殖。

圖3 不同濃度茶皂素對受試菌株細胞膜電位的影響Figure 3 Effects of different concentrations of tea saponin on cell membrane potential of tested strains

3.2.4 茶皂素對致病菌的細胞內容物的影響 不同濃度茶皂素在作用于金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌6 h后的細胞外核酸和可溶性蛋白質含量，比較結果見圖4~圖5。空白組（水）隨著培養時間的增長，細胞正常生長繁殖，細胞內特有物質——核酸（如DNA、RNA等）、蛋白質等的含量亦隨著上升；當加入茶皂素至1/2MIC時，對細胞膜未產生明顯的破壞作用，因此胞外核酸、蛋白質含量無顯著性提高（P>0.05）；而當2MIC加入茶皂素至MIC、2MIC時，藥物濃度的增加引起細菌細胞膜的破裂，內容物溢出，因此導致胞外核酸、蛋白質含量的顯著性上升（P<0.01）。結果表明，茶皂素具有破壞受試菌株細胞膜完整性的作用，且表現濃度依賴性。

圖4 不同濃度茶皂素對受試菌株細胞外核酸含量的影響Figure 4 Effects of different concentrations of tea saponin on extracellular nucleic acid content of tested strains

圖5 不同濃度茶皂素對受試菌株細胞外可溶性蛋白含量的影響Figure 5 Effects of different concentrations of tea saponin on the content of extracellular soluble protein of tested strains

4 討論

目前，在臨床上出現越來越多的致病菌產生耐藥性，導致現有的抗菌藥物正逐步失效、甚至無效，迫切需要開發出新的抗菌劑或通過相關技術方法提升現有藥物的抗菌活性。本文利用油茶果殼為原料制備出高純度的茶皂素，通過體外抗菌活性評價，明確其對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌的抗菌作用最強（抑菌環直徑為16.32 mm、15.63 mm，MIC均為0.39 mg/mL、MBC均為0.78 mg/mL）；抗菌作用機制研究中，發現當茶皂素濃度達到MIC、2MIC時，能夠破壞金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌的細胞壁與細胞膜結構和功能的完整性，引起細胞內容物AKP、核酸、蛋白質的滲出及降低細胞膜電位，影響菌體細胞的正常代謝，同時進一步誘導細胞死亡，從而發揮抑制其生長的作用，并且作用強度與藥物濃度成正相關。

雖然與現有抗生素相比，茶皂素在體外的抗菌作用仍較弱，但是其原料（油茶籽、油茶果殼等）來源十分豐富，因此生產成本低廉，同時還具備無殘留、無毒副作用、不易產生耐藥性、抗菌譜廣等優勢，值得進一步開展更為系統全面的體內外抗菌活性、聯合用藥等評價，為其開發為天然抗菌劑或抗菌增效劑奠定基礎，從而有望廣泛應用于動物養殖、醫藥衛生、化妝品及日用品等領域，實現降抗、替抗愿景。