基于UPLC-Q-TOF/MS技術的平喘顆粒化學成分分析

蔣鵬娜，李竹英，孫國東，霍金海

（1.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱 150040）

平喘顆粒來源于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院呼吸科臨床常用經驗方溫陽平喘湯，在臨床上應用已近50年。平喘顆粒由淫羊藿、炙麻黃、黃芪、太子參、五味子、款冬花、地龍、罌粟殼、知母等9味藥組成，具有溫陽益氣、化痰平喘之功效，用于治療哮喘慢性持續期陽虛痰盛型，亦可用于具有相同癥狀的其他咳喘病，具有較好的臨床療效[1-2]。

平喘顆粒是由9味中藥組成的復方制劑，成分復雜，藥效物質基礎不明確，前期僅采用高效液相色譜法測定淫羊藿苷、黃芪甲苷的含量，難以全面控制制劑質量[3]。因此，開發一種能夠快速分析和表征平喘顆粒化學成分的方法，對于有效控制方劑質量，進一步研究其作用機制及二次開發均具有現實意義。

近年來，將液相色譜的高效分離能力和質譜的高靈敏度相結合，尤其是與高分辨質譜和多級質譜聯合使用的技術手段，已廣泛應用于中草藥成分的分析，為研究天然產物開辟了全新的途徑。在前期總結平喘顆粒藥味已報道化合物一級質譜數據，以及研究系列對照品二級質譜裂解規律的基礎上，結合AB SCIEX公司Natural products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 software提供的1 000多種 中 藥對照品MS/MS譜圖信息，本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術對平喘顆粒樣品進行在線分離分析研究，利用UPLC一維的保留時間鎖定化合物，通過二維的精確質量數和同位素峰度比確定分子式，再通過對照品比對或質譜裂解規律分析鑒定或推斷結構式，旨為平喘顆粒的藥效物質基礎和質量控制研究提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC（美國Waters公司，包括二元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱）；AB SCEIX Triple-TOFTM5600+型質譜儀（AB SCI‐EX，USA，配有ESI源和APCI源）；數據采集軟件：Analyst TF 1.6 software（AB SCEIX，USA）；數據處理軟件系統：Peakview 2.0/masterview1.0 software（AB SCEIX，USA）、Markerview1.2.1（AB SCEIX，USA）、Natural products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 software（AB SCIEX，USA）。

KQ-300DB數控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BP211D電子天平（賽多利斯科學儀器公司）；BSA224S-CW電子天平（賽多利斯科學儀器公司）；LG16-W高速離心機（北京京立離心機有限公司）；ATC2-5-U艾科浦超純水機（重慶頤洋企業發展有限公司）；MDF-382E（N）超低溫冰箱（日本SANYO公司）。

1.2 試劑

甲醇、乙腈（色譜純，Merck公司）；甲酸（色譜純，Fisher公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；甲醇（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）。

1.3 藥材與對照品

平喘顆粒樣品由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院制備，規格10 g/袋。

芒柄花素（C-018-140126）、毛蕊異黃酮苷（M-020-1170926）、五味子乙素（W-001-140801）、綠原酸（RFS-L00701908029）、芒果苷（M-018-180511）、次黃 嘌 呤（C-069-181216）、氧 化 前 胡 素（Y-151-181008）由成都瑞芬思生物科技有限公司提供；次烏頭堿（798-9403）、酪氨酸（140624-200805）由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，加甲醇分別制成約50 μg/mL的溶液作為對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取平喘顆粒5.0 g，精密稱定，加75%（體積分數，下同）甲醇25 mL超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，0.22 μm濾膜濾過，取續濾液13 000 r/min離心5 min，取上清液，即得。

2.3 色譜條件

Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），AQUITY UPLC BEH C18VanGuard Pre-Column預柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）；流動相A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫（0~5 min，5%~25%B；5~15 min，25%~65%B；15~20 min，65%~70%B；20~29 min，70%~100%B；29~30 min，100%~100%B；30～30.1 min，100%~5%B；30.1~35 min，5%~5%B）；柱溫為30℃，流速為0.3 mL/min，進樣量為5 μL。

2.4 質譜條件

采用ESI離子源，離子化模式為電噴霧正、負離子模式，正負離子源電壓分別為5 500 V/-4 500 V，離子源溫度為550℃，裂解電壓（DP）分別為80 V/-80 V，碰撞能量（CE）分別為35 eV/-35 eV，碰撞能量擴展（CES）分別為15 eV/-15 eV。霧化氣體為氮氣，輔 助 氣Gas1為379.225 kPa，輔 助 氣Gas2為379.225 kPa，氣簾氣CurGas為241.325 kPa。一級質譜母離子掃描范圍為m/z80~1 500，IDA設置響應值超過100 cps的8個最高峰進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍為m/z50~1 500，開啟動態背景扣除（DBS）。

2.5 數據分析

2.5.1 目標性篩查（1）利用已建成的平喘顆粒化合物一級質譜數據庫（包括化合物分子式、分子量、中英文名稱、CAS號、結構類型、植物來源及參考文獻信息），使用Peakview 2.0/Masterview 1.0軟件中的“Targeted Peak Finding”功能載入已選擇的數據，設置Mass Error（質量數偏差）<10×10-6，權重=30%；Isotope（同位素分布）差異<10%，權重=30%；Formu‐la Finder score（分子式查找）>70%，權重=40%；利用masterview1.0軟件目標篩查功能對組分樣本進行篩查。（2）使用Natural products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 software（AB SCIEX，USA）進行篩查，該數據包含了1 000余種中草藥對照品的二級譜圖信息與樣品中的化合物進行自動匹配。

2.5.2 非目標性篩查 將采集數據導入Masterview 1.0（AB SCIEX，USA）軟件，通過peak finding options功能將數據中所有色譜峰按照設置參數母離 子 強 度>3 000 counts；S/N>10；MAX Element C50H200O50N20提取出來，按峰強度排序，選擇離子強度大且二級譜圖質量較好的化合物作為結構分析重點。

2.6 結構鑒定

在正負離子模式下，大多數化合物會產生[M+H]+或[M?H]?分子離子，Triple TOFTM 5600+高分辨質譜能夠在化學位移δ=5誤差范圍內測定大多數離子的精確質量數，并準確測定同位素豐度比。因此，通過Peakview 2.0 software軟件的Formula Finder功能，依據精確質量數及同位素豐度比可確定化合物的分子式。對于有對照品信息的化合物，進一步比對保留時間及二級質譜信息進行結構鑒定；對于無法獲得對照品的化合物，首先，依據其碎片離子的精確質量數計算其碎片組成，對比chemspider數據庫給出的可能結構式，再研究相似結構化合物的質譜裂解規律，通過Peakview 2.0軟件分析化合物質譜裂解特征以及文獻對比，結合二級譜圖相似度，從而推斷化合物結構。

3 結果與討論

3.1 UPLC/Q-TOF/MS數據采集結果

由于平喘顆粒化學成分復雜，采用一種模式很難顧全所有的化合物，因此采用正負2種離子掃描模式進行掃描，正負離子模式下的總離子色譜圖見圖1。結果表明，在正負離子模式下，各化合物均獲得了良好的分離效果及離子化效率。

圖1 平喘顆粒正負離子模式下總離子流圖Figure 1 TIC chromatograms of Pingchuan granules in positive and negative modes

3.2 結構鑒定

鑒定或推斷了平喘顆粒中35個化合物的結構，包括15個黃酮類化合物，主要來源于黃芪、淫羊藿、太子參、款冬花、知母等藥材；4個生物堿類化合物，來源于附子、罌粟殼及太子參；4個木脂素類化合物，全部來源于五味子；6個有機酸類化合物，分別來源于麻黃、款冬花、太子參、地龍、知母、附子；2個氨基酸類化合物，均來源于太子參、地龍；3個嘌呤類化合物，來源于太子參、地龍、知母；1個香豆素類化合物，來源于知母，結果見表1。

表1 （續）

表1 平喘顆粒中化合物結構信息表Table 1 Compound structure information of Pingchuan granules by UPLC-ESI-Q-TOF/MS

3.2.1 黃酮類成分的鑒定及分析 化合物1為黃芪、太子參、知母中共有的典型化合物，其準分子離子269[M+H]+豐度最高，首先A環上甲氧基斷裂失去甲基并發生氫重排，形成253[M+H-CH4]+碎片離子，而此離子碎片同時發生3種裂解途徑：一種失去C環上的CO中性碎片形成225[M+H-CO-CH4]+碎片離子，此碎片繼續碎裂失去B環上的CO中性碎片形成197[M+H-2CO-CH4]+及181[M+H-2COOCH4]+碎片離子；另一個途徑則失去B環上的4’-位的甲氧基形成237[M+H-O-CH4]+碎片離子，準分子離子也可A、C環發生裂解重排后產生213[M+HC2O2]+碎片離子。根據裂解方式及標準品比對[4]，推斷化合物1為芒柄花素，其二級質譜、裂解可能途徑分別見圖2、圖3。

圖2 芒柄花素二級質譜圖Figure 2 MS/MS spectrum for formononetin

圖3 芒柄花素可能的裂解途徑Figure 3 Possible fragmentation path way for formononetin

化合物2是黃芪、太子參共有的一個典型黃酮類成分，其準分子離子285[M+H]+豐度最高，其裂解路線較為單一，首先B環上4’-位甲氧基斷裂失去甲基形成270[M+H-CH3]+碎片離子，此離子碎片進一步丟失4’-位的OH并與3’-位羥基發生重排而形成253[M+H-CH3-OH]+碎片離子，253碎片失去CO中性分子形成225[M+H-CH3-OH-CO]+碎片離子，并發生A環RDA反應開環失去1個C形成213[M+HCH3-OH-CO-C]+碎片離子；另一條裂解途徑則由準分子離子直接丟失B環并發生重排產生碎片離子137[M+H-C9H8O2]+，此碎片提示A環上僅有1個羥基存在。根據裂解方式及對照品比對，推斷化合物2為毛蕊異黃酮，其二級質譜、裂解可能途徑分別見圖4、圖5。

圖4 毛蕊異黃酮二級質譜圖Figure 4 MS/MS spectrum for calycosin

圖5 毛蕊異黃酮可能的裂解途徑Figure 5 Possible fragmentation path way for calycosin

3.2.2 生物堿類成分的鑒定及分析 生物堿類成分結構較為復雜，化合物17為附子中典型的生物堿成分，其準分子離子616[M+H]+豐度最高，裂解途徑分為兩個方向：一個方向是失去飽和六元環上的甲氧基并發生氫的重排反應，形成584[M+H-OCH4]+碎片離子；另一個方向是失去飽和7元環上的乙酸根離子并發生氫重排形成556[M+H-CH3COOH]+碎片離子，此離子繼續失去飽和六元環上的甲氧基并發生氫的重排反應，形成524[M+H-CH3COOHOCH4]+碎片離子，而此碎片發生一系列裂解失去苯基、CO、甲基及開環失去N基并發生重排后形成338[M+H-CH3COOH-OCH4-C12H12NO]+碎片離子。根據裂解方式及對照品比對[5]，推斷化合物17為次烏頭堿，其二級質譜、裂解可能途徑分別見圖6、圖7。

圖6 次烏頭堿二級質譜圖Figure 6 MS/MS spectrum for hypaconitine

圖7 次烏頭堿可能的裂解途徑Figure 7 Possible fragmentation path way for hypaconitine

3.2.3 木脂素類成分的鑒定及分析 化合物21為五味子中典型的木脂素類成分，其準分子離子401[M+H]+的裂解分為兩條路線：一條為連續失去一個甲基及O形成386[M+H-CH3]+碎片離子及370[M+HCH3-O]+碎片離子；另外一條則由準分子離子401[M+H]+的連續發生八元環斷裂并發生重排反應形成300[M+H-5CH2-OCH3]+碎片離子，此碎片繼續丟失甲基形成285[M+H-5CH2-OCH3-CH3]+碎片離子。根據裂解方式及對照品比對[6-7]，推斷化合物21為五味子乙素，其二級質譜、裂解可能途徑分別見圖8、圖9。

圖8 五味子乙素二級質譜圖Figure 8 MS/MS spectrum for schisandrin B

圖9 五味子乙素可能的裂解途徑Figure 9 Possible fragmentation path way for schisandrin B

3.2.4 有機酸類成分的鑒定及分析 化合物29為典型的常見有機酸類成分，其準分子離子355[M+H]+豐度比較小，說明準分子離子所需極少能量即可打碎，而準分子離子極易失去奎寧酰基形成豐度最高的163[M+H-C7H12O6]+碎片離子，此離子失去苯環上的1個H2O形成145[M+H-C7H12O6-H2O]+碎片離子，同時也能失去CO形成135[M+H-C7H12O6-CO]+碎片離子，繼而失去苯環上的1個H2O形成117[M+H-C7H12O6-CO-H2O]+碎片離子。根據裂解方式及對照品比對[8]，推斷化合物29為綠原酸，其二級質譜、裂解可能途徑分別見圖10、圖11。

圖10 綠原酸二級質譜圖Figure 10 MS/MS spectrum for chlorogenic acid

圖11 綠原酸可能的裂解途徑Figure 11 Possible fragmentation path way for chlorogenic acid

3.2.5 氨基酸類成分的鑒定及分析 化合物31為常見氨基酸，其準分子離子182[M+H]+豐度比較小，裂解途徑有兩條路線，首先失去1個H2O及NH3中性碎片并發生環合反應形成147[M+H-H2O-NH3]+碎片離子，此離子發生開環反應失去2個C形成123[M+H-H2O-NH3-2C]+碎片離子，準分子離子亦可連續失去甲酸根及NH3形成136[M+H-HCOOH]+碎片離子和119[M+H-HCOOH-NH3]+碎片離子。根據裂解方式及對照品比對[9]，推斷化合物31為酪氨酸，其二級質譜、裂解可能途徑分別見圖12、圖13。

圖12 酪氨酸二級質譜圖Figure 12 MS/MS spectrum for tyrosine

圖13 酪氨酸可能的裂解途徑Figure 13 Possible fragmentation path way for tyrosine

3.2.6 嘌呤類成分的鑒定及分析 嘌呤類成分質譜碎片較少，可能由于分子量較小及結構較多環合很難形成碎片離子，化合物32為地龍中典型的嘌呤類成分，其準分子離子137[M+H]+可以失去1個H2O形成119[M+H-H2O]+碎片離子，準分子也可發生開環失去CHN并發生重排反應形成110[M+H-CHN]+碎片離子。根據裂解方式及標準品比對，推斷化合物32為次黃嘌呤，其二級質譜、裂解可能途徑分別見圖14、圖15。

圖14 次黃嘌呤二級質譜圖Figure 14 MS/MS spectrum for 6-hydroxypurine

圖15 次黃嘌呤可能的裂解途徑Figure 15 Possible fragmentation path way for 6-hydroxypurine

3.2.7 香豆素類成分的鑒定及分析 化合物35為知母中香豆素類成分，其準分子離子287[M+H]+失去支鏈形成豐度最高的203[M+H-C5H8O]+碎片離子，此碎片離子發生五元環開環反應并同時失去O形成147[M+H-C5H8O-C2O2]+碎片離子，147碎片離子進一步失去O形成131[M+H-C5H8O-C2O3]+碎片離子，也可失去CO形成119[M+H-C5H8O-C2O2-CO]+碎片離子。根據裂解方式及對照品比對，推斷化合物35為氧化前胡素，其二級質譜、裂解可能途徑分別見圖16、圖17。

圖16 氧化前胡素二級質譜圖Figure 16 MS/MS spectrum for oxypeucedanin

圖17 氧化前胡素可能的裂解途徑Figure 17 Possible fragmentation path way for oxypeucedanin

4 討論

藥效學研究表明，平喘顆粒具有較好的鎮咳、祛痰、抗急（慢）性炎癥、抗疲勞、抗乏氧、提高免疫力、平喘作用[10]；能減輕哮喘后的炎癥反應，抑制細胞自噬信號通路[11]，改善和控制氣道重塑過程中氣道高反應和氣道阻塞的狀態，并可抑制EGF mRNA的表達[12]，從而保護肺部組織細胞，減輕哮喘發作。平喘顆粒還可以保護16HBE細胞，降低其凋亡率、自噬數量，抑制Caspase-3以及Beclin-1的表達[13]；可以抑制Akt、mTOR的磷酸化，從而抑制自噬的發生，可能與調控PI3K/Akt/mTOR信號通路有關[14]。

本研究采用HPLC-Q-TOF/MS聯用技術，首次對平喘顆粒的化學成分進行了系統研究，鑒定或推斷了平喘顆粒中35個化合物的結構，包括15個黃酮類、4個生物堿類、4個木脂素類、6個有機酸類、2個氨基酸類、3個嘌呤類、1個香豆素類化合物。當中的部分成分具有顯著的生物活性，如蘆丁和芒柄花素能夠抑制氣道炎癥與重塑的作用[15-16]，毛蕊異黃酮和槲皮素能減輕哮喘炎癥反應[17-19]，木犀草素和五味子醇甲可以減少氣道高反應性、降低氣道阻力、減少黏液過多的分泌、減少炎性細胞對肺組織的浸潤[20-21]，異鼠李素具有抑制炎癥反應、修復肺組織、減輕組織損傷的作用[22]，五味子乙素能夠逆轉因哮喘導致的氣道壁厚度增加的趨勢、起到減輕病情的作用[23]，亞油酸可以抑制哮喘狀況下過分活躍的免疫系統、減輕免疫損傷的發生[24]，等等。

本研究分析鑒定了平喘顆粒中35個化合物的結構，以黃酮類、生物堿類、有機酸類等為主，這些化合物的結構通過高分辨質譜得到了初步的推斷，有助于系統了解平喘顆粒所含化學成分，并為活性成分的定向提取分析及質量控制方法的建立提供借鑒，也可以為組方中各藥味所含化學成分的質譜裂解途徑研究提供借鑒和參考。