丹參-紅花配方顆粒與傳統湯劑的主要成分及藥效初步評價

周慧慧，張美菊，杜少兵，李菁，高速，白吉慶，王小平，2

（1.陜西中醫藥大學藥學院，陜西咸陽 712046；2.陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西咸陽 712046）

中藥湯劑是我國應用最早、最廣泛的一種常用劑型，可根據臨床癥狀進行加減，處方靈活[1-2]，具有吸收快、制備簡單、可以迅速發揮藥效等優點[3]，但是隨著現代生活節奏的加快，湯劑耗時、費力，使用、攜帶、儲存不便，不適應現代快節奏的生活，使得其臨床使用受限[4]。采用現代工藝和制藥技術，對中藥飲片進行提取、分離、濃縮、干燥、制粒等處理而制成的中藥配方顆粒，具有性質穩定、易于調劑、攜帶、服用、儲存、運輸方便等優點[5-6]。

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltior‐rhizaBge.的干燥根及根莖，具有活血化瘀、通經止痛之功效[7]。紅花為菊科植物紅花Carthamus tinc‐toriusL.的干燥花序，具有活血通經、散瘀止痛之功效[8]。丹參-紅花是常用的活血化瘀藥對，在治療心血管疾病等方面已廣泛應用數百年，常出現在一些用于心腦血管疾病的中藥復方中（丹紅化瘀口服液、丹紅注射液、心寧片等）[9-10]。目前，對于丹參-紅花湯劑與配方顆粒之間一致性評價的文獻報道較少，本研究從主要藥效成分和抗心肌缺血2個方面對該藥對的配方顆粒和湯劑進行研究，以評價該藥對的配方顆粒和湯劑在上述2個方面的一致性，為丹參-紅花藥對的開發利用提供試驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Discovery DV215CD電子分析天平（瑞士賽多利斯集團；0.01 mg/0.1 mg）；戴安Ultimate 3000全自動高效液相色譜儀。

1.2 試劑與試藥

丹參采自山東省菏澤市鄄城縣，紅花采自新疆維吾爾自治區塔城市裕民縣，均經陜西中醫藥大學中藥鑒定教研室白吉慶教授鑒定，丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花；藥用輔料糊精（批號：20191021，遼寧東源藥業有限公司）；丹參對照藥材（批號：120923-201615）、紅花對照藥材（批號：120907-201412）均由中國食品藥品檢定研究院提供；硅膠G薄層色譜板（批號G20181108，100 mm×200 mm，青島海洋化工有限公司）；丹酚酸B對照品（批號：111562-201716，質量分數≥99.8%）、丹參素對照品（批號：DST170420-015，質量分數≥98.0%）均由成都德思特生物技術有限公司提供；紫草酸對照品（批號：19053003，質量分數≥99.8%，森嵐科技有限公司）；迷迭香酸對照品（批號：BZP0004，質量分數≥98.0%，江西佰草源生物科技有限公司）；羥基紅花黃色素A對照品（批號：111637-201810，質量分數≥93.1%，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈（色譜純，美國默克公司）；水為超純水（自制）；氯化鈉注射液（批號：2011291B，西安京西雙鶴藥業有限公司）；蘇木精（批號：H8070，上海源葉生物科技有限公司）；復方丹參滴丸（批號：190322，天士力醫藥集團股份有限公司）；鹽酸異丙腎上腺素（批號：P1794259，Sigma公司）。

1.3 動物

SD雄性大鼠60只，體質量180~220 g，購自成都達碩有限公司，合格證號SCXK（川）2020-030，每籠10只，飼養環境為（25±5）℃（環境溫度）、（45±5）%（相對濕度），正常飲食適應1周。

1.4 丹參-紅花配方顆粒的制備

取丹參450 g，加入4 800 mL的水，常溫浸泡60 min，加入150 g的紅花，50℃浸泡120 min，放至室溫，濾過，濾渣加8倍量的水再提取2次，每次120 min，濾液合并減壓濃縮后干燥，得干膏粉。取干浸膏粉和糊精（質量比為1∶1），混合均勻，以體積分數70%的乙醇為潤濕劑，制備軟材，制粒，60℃干燥20 min，即得。

1.5 丹參-紅花傳統湯劑的制備

取丹參300 g，加3 200 mL的水，浸泡30 min，加入紅花100 g，煎煮60 min，冷卻，濾過，減壓濃縮至每1 mL含1.44 g的原藥材，即得。

2 方法與結果

2.1 定性分析

吸取“1.5”項湯劑作為湯劑的供試品溶液。取丹參-紅花配方顆粒適量，研細，取1 g，加甲醇5 mL，超聲（功率120 W，頻率45 kHz）30 min，濾過，濾液作為配方顆粒的供試品溶液。分別取丹參、紅花對照藥材粉末各1 g，按“1.5”項方法制備對照藥材溶液。精密稱取丹酚酸B對照品10 mg、羥基紅花黃色素A對照品5 mg，分別置10 mL的量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液。取糊精1 g，按“1.4”項方法制備陰性對照溶液。按照2020年版《中國藥典》附錄“薄層色譜法”，吸取上述溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-冰醋酸-水-甲醇（體積比5.5∶1∶1∶0.2）為展開劑，展開15 cm，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，而陰性無干擾。見圖1。

圖1 丹參-紅花配方顆粒及傳統湯劑的薄層色譜圖Figure 1 Thin-layer chromatogram of Danshen-Honghua dispensing granules and traditional decoction

2.2 定量分析

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為乙腈，B為0.2%磷酸水，梯度洗脫（0~5 min，94%~90%B；5~7 min，90%~85%B；7~8 min，85%~79%B；8~18 min，79%~79%B；18~25 min，79%~52%B；25~28 min，52%~0%B；28~35 min，0%B）；柱溫：30℃；檢測波長：288 nm；流速：1 mL/min。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取丹參素0.84 mg、迷迭香酸0.58 mg、紫草酸0.35 mg、丹酚酸B 3.14 mg，置100 mL的量瓶中，加甲醇超聲（功率120 W，頻率45 kHz）5 min，并定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 顆粒：取丹參-紅花配方顆粒適量，研細，取0.2 g，精密稱定，置25 mL的量瓶中，加甲醇超聲（功率120 W，頻率45 kHz）5 min，冷卻后加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得（每1 mL含0.01 g原藥材）。湯劑：取“1.5”項丹參-紅花湯劑1 mL，置100 mL的量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得（每1 mL含0.01 g原藥材）。

2.2.4 陰性對照溶液 按樣品制備工藝制備不含丹參的陰性樣品，照上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.2.5 系統適用性試驗 分別精密吸取上述混合對照品溶液和供試品溶液各5 μL，按“2.2.1”項色譜條件測定。結果顯示，在供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置，有色譜峰，且陰性對照無干擾，見圖2。

圖2 系統適用性試驗HPLC色譜圖Figure 2 HPLC chromatograms of system suitability

2.2.6 線性與范圍 分別精密吸取“2.2.2”項混合對照品溶液1、2、5、8、10 μL，注入液相色譜儀，記錄各待測成分的峰面積，以進樣量（X，ng）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得到丹參素、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的回歸方程分別為Y=0.003 2X?0.000 1、Y=0.026 8X?0.060 5、Y=0.017 1X?0.006 2、Y=0.013 2X?0.036 5，線性范圍分別為8.40~84.00 ng（r=0.999 5）、5.80~58.00 ng（r=0.999 7）、3.50~35.00 ng（r=0.999 4）、31.40~314.00 ng（r=0.999 5），表明各待測成分在相應進樣量范圍內線性關系良好。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取同一濃度的混合對照品溶液，連續進樣6次，結果顯示丹參素、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B峰面積的RSD值均小于1.3%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 分別精密吸取配方顆粒和傳統湯劑的供試品溶液，于0、3、6、9、12、24 h進樣5 μL測定，記錄各待測成分的峰面積，結果顯示配方顆粒中各待測成分峰面積的RSD均小于1.8%，傳統湯劑中各待測成分峰面積的RSD均小于1.6%，表明各供試溶液中待測成分24 h內基本穩定。

2.2.9 重復性試驗 分別取同一批號的配方顆粒和傳統湯劑各平行6份，按“2.2.3”項方法制備平行的6份溶液，依法測定，結果顯示配方顆粒中丹參素、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的平均質量分數分別 為（0.060±0.020）、（0.028±0.015）、（0.036±0.014）、（0.335±0.012）mg/mL，RSD值均小于1.8%（n=6）；湯劑中丹參素、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的平均質量濃度分別為（0.019±0.009）、（0.033±0.021）、（0.013±0.017）、（0.105±0.019）mg/mL，RSD值均小于2.4%（n=6），表明方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取同一批丹參-紅花配方顆粒0.1 g，精密稱定，平行9份，置25 mL量瓶中，分別精密加入一定量的丹參素、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B對照品適量，按“2.2.3”項方法制備溶液，依法測定，結果見表2。取丹參-紅花傳統湯劑0.5 mL置100 mL的量瓶中，分別精密加入一定量的丹參素對照品、迷迭香酸對照品、紫草酸對照品和丹酚酸B對照品，按“2.2.3”項方法制備溶液，依法測定，結果顯示各成分的平均加樣回收率在97.89%~101.86%之間，RSD值均小于0.03%，表明方法準確度良好，見表1、表2。

表1 丹參-紅花配方顆粒加樣回收率試驗結果Table 1 The recovery results of Danshen-Honghua dispensing granules(n=9)

表2 丹參-紅花傳統湯劑加樣回收率試驗結果Table 2 The recovery results of Danshen-Honghua traditional decoction(n=9)

2.2.11 樣品的測定 取配方顆粒、湯劑各3批，每個批次做3個平行樣，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，依法測定，結果見表3?？梢?，配方顆粒劑中除迷迭香酸外，丹參素、丹酚酸B和紫草酸的質量濃度均高于湯劑。

表3 樣品測定結果Table 3 Determination results of samples(±s,n=3) ρ/(mg·mL-1)

表3 樣品測定結果Table 3 Determination results of samples(±s,n=3) ρ/(mg·mL-1)

與傳統湯劑比較：*P<0.05；**P<0.01。

樣品配方顆粒傳統湯劑丹參素0.060±0.020**0.019±0.009迷迭香酸0.028±0.015 0.033±0.021紫草酸0.036±0.014*0.013±0.017丹酚酸B 0.335±0.012**0.105±0.019

2.3 藥效初步研究

2.3.1 分組、造模及給藥 將60只大鼠，隨機分為空白組、模型組、陽性組（復方丹參滴丸，73 mg/kg）、丹參-紅花湯劑組（14.4 g/kg）、丹參-紅花顆粒組（14.4 g/kg）、輔料糊精組（14.4 g/kg），共6組（10只/組）。灌胃體積2 mL/200 g大鼠，空白組、模型組蒸餾水灌胃，其余各組給予相應的藥物連續7 d，于第6天、第7天灌胃1 h后，空白組皮下注射0.9%生理鹽水，其余各組皮下注射鹽酸異丙腎上腺素生理鹽水溶液（85 mg/kg），于末次造模12 h后，取出大鼠心臟，置10%甲醛溶液中固定。

2.3.2 HE染色 取固定后的組織→脫水→浸蠟→包埋→切片（4μm）→脫蠟→染色（蘇木精染色5 min，將浮色洗去，鹽酸酒精分化數秒，自來水返藍，浸入伊紅染液復染5 min）→脫水→透明→封片→置光學顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

2.3.3 結果 從圖3可見，空白組的心肌細胞排列整齊，心肌細胞形態及橫縱紋均正常，未出現炎性細胞浸潤等情況；與空白組比較，模型組心肌損傷明顯，心肌纖維紊亂，出現水腫，大量炎癥細胞浸潤，說明造模成功；與模型組比較，輔料組無明顯變化，陽性對照組、丹參-紅花配方顆粒組和湯劑組的心肌病理均有明顯改善，陽性組的大部分心肌纖維排列整齊，心肌纖維較窄，炎癥細胞浸潤減少，丹參-紅花配方顆粒組和湯劑組的心肌纖維均無明顯水腫且排列整齊，心肌細胞核大小均勻，無明顯差異。

圖3 心肌病理切片Figure 3 Pathological section of myocardium（200×）

3 討論

TLC是中藥常用的定性分析方法，故本研究采用TLC法，為了增強方法的專屬性，采用對照藥材和對照品同時對照，對丹參-紅花配方顆粒和湯劑進行定性研究。在實驗過程中，分別對展開劑、展距、點樣量、展開環境等進行了選擇，當室溫為10~30℃、濕度為1%~10%時，均不影響色譜行為。乙酸乙酯-冰醋酸-水-甲醇（體積比5.5∶1∶1∶0.2）為展開劑，展距15 cm，主斑點圓整、清晰、且分離效果好。TLC結果顯示，配方顆粒及湯劑中均可以檢出7個主斑點，經對照品對照其中2個分別為丹酚酸B和羥基紅花黃色素A。

HPLC是中藥常用的定量分析方法，丹參素、迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸等成分均有紫外吸收，故本研究采用HPLC-UVD法對上述成分進行定量分析，對供試品溶液制備方法、色譜條件進行了考察，結果以本文確立的提取方法和色譜條件的待測成分的分離度良好，基線平整；同時考察了3種不同品牌的色譜柱（Thermo Hypersil GOLD C18、Symmetry C18柱、Diamonsil C18柱）、3種不同品牌的液相色譜儀（戴安、沃特斯、安捷倫）的影響，結果顯示不同品牌的色譜柱和不同品牌的色譜儀均不影響待測成分的分析，說明方法耐用性良好。

丹參素、迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸和羥基紅花黃色素A是丹參-紅花藥對中的主要活性成分，具有活血通經、祛瘀止痛等功效[11-13]，在抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗心律失常等方面發揮重要的藥理作用[14-17]，由于丹參素、迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸的質量分數相對較高，而羥基紅花黃色素A的質量分數相對較低，同時測定上述成分時，需要的樣品濃度較大，對分析柱不利，故采用HPLC法測定了配方顆粒與湯劑中丹參素、迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸4種成分的含有量。結果顯示，配方顆粒中除了迷迭香酸的質量分數略低于湯劑，其他成分的均高于湯劑。制備丹參-紅花配方顆粒與傳統湯劑的中藥飲片均為同一批次，但在高效液相色譜圖中，丹參-紅花配方顆粒比湯劑多了一個色譜峰，說明配方顆粒比湯劑的化學成分豐富，這可能與制備工藝有關。

通過大鼠心肌病理切片對丹參-紅花配方顆粒與湯劑抗心肌缺血的效應進行初步評價，通過比較分析，評價其效應的一致性。復方丹參滴丸是由丹參、冰片、三七組成，具有消腫止痛、涼血消癰及活血通經的功效，臨床常用于心絞痛、冠心病以及心腦血管類疾病的治療[18-19]。據文獻報道，復方丹參滴丸對于鹽酸異丙腎上腺素誘導的急性心肌缺血具有明顯改善心肌收縮、舒張功能的作用，還可以減輕心肌缺血造成的損傷，對心肌具有一定的保護作用[20]，故本研究以復方丹參滴丸作為陽性對照藥。HE染色結果表明，與空白組比較，模型組大鼠心肌損傷嚴重，心肌纖維排列紊亂等，表明實驗造模成功；與模型組比較，陽性對照組心肌纖維排列紊亂明顯改善，心肌纖維排列整齊，且炎性細胞浸潤明顯減少；與模型組比較，丹參-紅花配方顆粒組及湯劑組，心肌細胞排列整齊且無明顯水腫，炎癥細胞浸潤減少，細胞核清晰，說明丹參-紅花配方顆粒及湯劑均對急性心肌缺血模型大鼠損傷心肌有明顯改善作用，且配方顆粒、湯劑和陽性組藥效無明顯差異。

綜上所述，丹參-紅花配方顆粒和湯劑在主要成分和改善心肌缺血方面基本一致，為丹參-紅花配方顆粒替代湯劑應用于臨床提供了實驗依據。