基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討貓爪草異病同治的作用機(jī)制

劉莉，王鳳云，王卓，李衛(wèi)東，韓亮

（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)健康學(xué)院，廣東廣州 510006；3.廣東省光與健康工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510310）

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)運用算法與軟件分析，通過構(gòu)建“成分－靶點－疾病”網(wǎng)絡(luò)，可以闡明多組分、多途徑和多靶點藥物在分子水平上的潛在機(jī)制，了解成分、基因、蛋白質(zhì)和疾病之間的相互作用關(guān)系［1］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法展開研究，為闡釋貓爪草（Ranunculus ternatusThunb.）對腫瘤和肺結(jié)核異病同治的作用機(jī)制提供參考和理論依據(jù)［2-3］。

早期臨床應(yīng)用報道貓爪草湯劑能治療隆突性皮膚纖維肉瘤至痊愈，術(shù)后未見復(fù)發(fā)［4］。體外實驗證實貓爪草乙醚提取物對腫瘤壞死因子有較強(qiáng)的誘生作用，并且貓爪草皂苷與多糖均可抑制癌細(xì)胞［5-6］。在耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)使得抗結(jié)核形勢非常嚴(yán)峻的情況下，貓爪草體現(xiàn)出在針對耐藥性肺癆的治療、減輕毒副作用等方面的明顯優(yōu)勢，并且與西藥共同輔助治療肺結(jié)核成效顯著［7-8］。貓爪草活性成分具有抗腫瘤、抗肺結(jié)核、抑菌、調(diào)節(jié)免疫活性等多種藥理作用［9］，但查詢大量文獻(xiàn)資料顯示其具體抗腫瘤、抗肺結(jié)核作用機(jī)制尚不明確，開發(fā)研究階段還未成熟。因此，本研究以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，結(jié)合現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)技術(shù)，探討貓爪草作用于腫瘤和肺結(jié)核的分子機(jī)制，為深入闡釋貓爪草“異病同治”提供參考。

1 方法

1.1 化學(xué)成分的篩選及靶點預(yù)測

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），篩選貓爪草主要的活性化合物，以參數(shù)口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為條件，并結(jié)合使用Swiss target pre‐diction數(shù)據(jù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行靶點預(yù)測，以probabiity>0.05進(jìn)行相關(guān)靶點篩選。將最終獲得化合物的蛋白靶點，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中的ID mapping進(jìn)行官方名稱校正。

1.2 治療腫瘤和肺結(jié)核的共同靶點獲取

通過GeneCard數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http：//disgenet.org/）搜集腫瘤、肺結(jié)核相關(guān)疾病靶點，將2種疾病靶點與化合物靶點取三者共同交集，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建“成分－靶點－疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.3 關(guān)鍵共有靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將獲得的共同靶點通過STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string?db.org/）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，之后導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0進(jìn)行可視化分析。

1.4 GO富集功能與KEGG通路富集分析

運 用DAVID6.8數(shù) 據(jù) 庫（https：//david.ncifcrf.gov/）將“1.3”項下獲得的關(guān)鍵共同靶點進(jìn)行GO功能與KEGG通路富集分析。其中以參數(shù)P<0.05，設(shè)定為HOMO species篩選出count值前10來分析生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular‐function，MF）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）的GO富集功能和KEGG信號通路。最后用易漢博生物在線作氣泡圖進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 核心化合物與核心靶點的分子對接

將“1.1”項下整理出的所有活性成分與“1.2”項下PPI網(wǎng)絡(luò)分析度值排名靠前的藥物靶點進(jìn)行分子對接，利用PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載核心靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)PDB格式，TCMSP數(shù)據(jù)庫結(jié)合ZINC數(shù)據(jù)庫下載化合物mol2格式，運用iGEM‐DOCK軟件進(jìn)行分子對接，然后使用易漢博生物在線作圖計算結(jié)合自由能。

1.6 體外細(xì)胞實驗驗證

1.6.1 試劑與儀器 超凈工作臺（廣州吉迪有限公司），顯微鏡（奧林巴斯有限公司），A700-8臺式離心機(jī)（泰州醫(yī)療科技有限公司），酶標(biāo)儀（上海鼎謙生物科技有限公司），貓爪草膠囊（信合援生制藥股份有限公司，批號Z41021788），二甲基亞砜（廣州瑞舒生物科技有限公司），RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco，lot：12556），結(jié)核分枝桿菌（中國科學(xué)院數(shù)據(jù)庫），MMP9 ELISA試劑盒（catalog，DYC827B-2，安迪生物科技公司），異煙肼（深圳振強(qiáng)生物技術(shù)有限公司）。

1.6.2 MTT檢測細(xì)胞活性 通過結(jié)核桿菌活性試驗，檢測貓爪草對肺結(jié)核的抑制作用。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2孵育1~2周，觀察狀態(tài)，取生長的細(xì)胞2×105個按0.1 mL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，設(shè)置空白組、對照組、給藥組（低、中、高劑量共3組，分別加入質(zhì)量濃度為50、100、200 mg/L DMSO溶解的貓爪草膠囊），作用20 h后，取出按10 μL/孔加濃度為5 mg/mL MTT溶液，混勻后置培養(yǎng)箱4 h，吸取上清液，每孔加150 μL DMSO并在震板上10 min后在450 nm上測吸光度（A）值，按公式計算抑制率，抑制率=（1?A給藥組）/A對照組×100%。

1.6.3 ELISA檢測細(xì)胞因子含量 通過對MMP9因子調(diào)節(jié)作用的測定，驗證貓爪草對肺結(jié)核抑制的具體靶點。取“1.6.2”項細(xì)胞上清液，增加陽性對照組，參考試劑盒說明書，采用ELISA檢測血清中MMP9細(xì)胞因子分泌水平。

1.6.4 數(shù)據(jù)處理 所有統(tǒng)計分析和圖片均使用GraphPad prime軟件進(jìn)行處理，實驗結(jié)果采用表示，組間比較采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分的篩選及靶點預(yù)測

將中藥貓爪草輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫中查詢，共有79種化合物，按“1.1”項下參數(shù)設(shè)置后搜索到12種化合物，并結(jié)合Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選出11種活性化合物，基本信息見表1。使用Uni‐prot數(shù)據(jù)庫校正整理出171個蛋白靶點。

表1 貓爪草中11種活性化合物的基本信息表Table 1 Basic information of 11 compounds in R.ternatus Thunb.

2.2 治療腫瘤和肺結(jié)核共同靶點的獲取

通過GeneCard、DisGeNET、TTD數(shù)據(jù)庫搜集腫瘤、肺結(jié)核相關(guān)疾病靶點，去重后獲得腫瘤靶點，運用score中位數(shù)篩選出腫瘤靶點1 230個，肺結(jié)核靶點1 216個，使用易漢博生物信息在線做Venn圖，將2種疾病靶點與化合物靶點三者共同交集，詳細(xì)信息見圖1。獲得共同關(guān)鍵靶點22個，分別是ABCB1、

圖1 腫瘤、肺結(jié)核和貓爪草活性化合物關(guān)鍵共有靶點交集venn圖Figure 1 Intersection venn diagram of key common targets of tumor,tuberculosis and active compounds of R.ternatus Thunb.

AHR、ALOX5、BCL2、CYP17A1、EDNRA、GUSB、MCL1、MET、MMP2、MMP9、NOS2、PLA2G2A、PLG、PPARG、SERPINE1、SRC、STAT1、SYK、TERT、VDR、VEGFA，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建“化學(xué)成分?共同靶點?腫瘤和肺結(jié)核”疾病網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖2 化學(xué)成分-靶點-腫瘤和肺結(jié)核疾病網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Nerwork diagram of chemical compositim-targertumor and tuberculosis disease

2.3 關(guān)鍵共有靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將獲得的22個共同靶點通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0進(jìn)行可視化分析。其中圓形節(jié)點為靶點，連線為靶點相互作用關(guān)系，圓點顏色越深代表度值越大，連線越粗代表相互關(guān)系越重要。從圖3可見，在共有靶點中按度值從大到小排序分別是VEGFA、SRC、

圖3 腫瘤、肺結(jié)核和貓爪草活性化合物關(guān)鍵共有靶點網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 Network diagram of key common targets in tumors,tuberculosis and active compounds of R.ternatus Thunb.

MMP9、PPARG、MMP2、STAT1、MCL1、AHR、MET。這些核心靶點在貓爪草發(fā)揮異病同治的機(jī)制中起到重要作用。

2.4 GO富集功能與KEGG通路富集分析

將按“1.3”項下方法操作獲得的關(guān)鍵共同靶點導(dǎo)入DAVID6.8數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能與KEGG通路富集分析。獲得BP 69個，主要涉及積極監(jiān)管RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄、負(fù)調(diào)節(jié)凋亡過程、細(xì)胞增殖等。獲得MF 20個，主要涉及蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚活動、受體結(jié)合等。獲得CC 14個，主要涉及等離子體膜、細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域等。通過易漢博生物在線作圖，以count值前10與P值≤0.05篩選結(jié)果見圖4。KEGG信號通路有14條，主要與癌癥通路、肺結(jié)核、癌癥小分子核糖核酸、癌癥蛋白聚糖、PI3K-Akt信號通路、膀胱癌、HIF-1信號通路、弓形體病、乙型肝炎等有關(guān)。以count值前10與P≤0.05篩選，結(jié)果見圖5。

圖4 貓爪草核心靶點的GO生物富集分析氣泡圖Figure 4 Bubble diagram of GO bio?enrichment analysis of core target of R.ternatus Thunb.

圖5 貓爪草核心靶點的KEGG富集分析氣泡圖Figure 5 KEGG enrichment analysis bubble chart of the core target of R.ternatus Thunb.

2.5 分子對接驗證

使用iGEMDOCKv2.1分子對接軟件對交集靶點中degree值前8的靶點進(jìn)行分子對接分析。核心受體靶點均從PDB數(shù)據(jù)獲得，分別為VEGFA（PDB ID：1CSK）、SRC（PDB ID：1L6J）、MMP9（PDB ID：2VV2）、MMP2（PDB ID：5TH9）、STAT1（PDB ID：5Y7Y）、MCL1（PDB ID：6o6g）、AHR（PDB ID：6v7k）、MET（PDB ID：7d3f）。“2.1”項下篩選出已有文獻(xiàn)證實的核心化合物，分別為異銀杏雙黃酮（isoginkgetin）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、植物甾醇（stigmasterol）、菜 油 甾 醇（campesterol）、膽 固 醇（CLR），根據(jù)經(jīng)驗打分函數(shù)發(fā)現(xiàn)這5種核心化合物均作用于核心受體靶點，見圖6。5種核心化合物均與靶點有良好的親和力，其中異銀杏雙黃酮與各個靶點結(jié)合能最低，對接活性最好。

圖6 貓爪草核心化合物與靶點的分子對接熱圖Figure 6 Molecular docking heat map of core compound and target of R.ternatus Thunb.

2.6 體外細(xì)胞實驗驗證

2.6.1 貓爪草對結(jié)核桿菌的抑制作用 從表2可知，各給藥組與對照組比較，A值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），高劑量組抑制率達(dá)97%，抑制結(jié)核桿菌生長效果呈劑量遞增，具有劑量依賴性。

表2 貓爪草對結(jié)核分枝桿菌活性的影響Table 2 The effect of R.ternatus Thunb on the activity ofMycobacterium tuberculosis（n=6）

2.6.2 貓爪草對MMP9表達(dá)影響 與空白組比較，陽性對照組MMP9細(xì)胞表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與陽性對照組比較，貓爪草中、高劑量組細(xì)胞表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），見圖7。

圖7 貓爪草對MMP9表達(dá)的影響Figure 7 The effect of R.ternatus Thunb on the expression of MMP9

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為腫瘤屬于“積聚”“癥瘕”范圍，其主要病因是臟腑虛勞，痰瘀毒聚的有形之邪侵入，使正氣不足，難以固本[10]；肺癆則是陰虛導(dǎo)致正氣虧耗，外受“癆蟲”所染，邪乘虛而入。2種疾病雖病理特征不同，但都是病機(jī)“虛證”為主，氣血虧損、臟器受外邪侵入而導(dǎo)致發(fā)病，且都具有潛伏期較長、過程緩慢、常年積累而促成等特點。貓爪草味甘、辛，性溫，歸肝、肺經(jīng)，屬于養(yǎng)陰藥，主治陰虛證[11-14]，入肝補血、滋陰潤肺達(dá)到扶正作用，消散消腫、解毒化瘀達(dá)到祛邪作用，故假設(shè)二者結(jié)合起到補虛固本的治療腫瘤與肺結(jié)核的作用。這在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論上，為貓爪草“異病同治”的作用機(jī)制提供參考依據(jù)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從貓爪草篩選出11種核心活性物質(zhì)，其中貓爪草皂苷、多糖在抗腫瘤、結(jié)核方面研究較多[15-18]，鄰苯二甲酸正丁異辛酯、亞油酸乙酯、β-谷甾醇乙酸酯、7-O-甲基圣草酚等活性成分對疾病作用機(jī)制的相關(guān)實驗驗證較少，還有待深入研究。分子對接結(jié)果顯示，異銀杏雙黃酮、β-谷甾醇、植物甾醇、菜油甾醇、膽固醇這5種核心化合物對于VEGFA、SRC、MMP9、PPARG、MMP2、STAT1、MCL1、AHR、MET這8個核心靶點具有相互作用，其中異銀杏雙黃酮可能是治療肺結(jié)核和腫瘤的主要活性成分。但仍需后期開展體內(nèi)外實驗證實貓爪草作用于這2種疾病的分子作用機(jī)制。

KEGG信號通路富集結(jié)果顯示，8個核心靶點主要通過PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、癌癥通路、肺結(jié)核信號通路發(fā)揮作用。腫瘤細(xì)胞無限增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要原因，一般通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、抑制DNA的合成、抑制腫瘤細(xì)胞的分裂達(dá)到抗腫瘤的目的。PI3KAkt通路對惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移起著重要的作用[19]，貓爪草中異銀杏雙黃酮、β-谷甾醇在其通路上發(fā)揮著顯著的抗癌功效。谷甾醇通過Bcl-2和PI3K-Akt信號通路誘導(dǎo)G2/M阻滯、內(nèi)重復(fù)和凋亡，阻止癌細(xì)胞增殖[20]。異銀杏雙黃酮通過PI3K-Akt通路抑制Akt與MMP-9的活性，減少細(xì)胞的侵襲，從而達(dá)到抗乳腺癌和黑色素瘤的作用[21]。此外，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）是腫瘤微環(huán)境中一類重要的炎性細(xì)胞，貓爪草中小毛茛內(nèi)酯通過PI3K-Akt通路巨噬細(xì)胞極化來影響腫瘤的代謝[22-23]。TAMS與炎癥因子（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）等因素能造成腫瘤細(xì)胞的增殖、生長與轉(zhuǎn)移[24-25]。HIF-1缺氧誘導(dǎo)因子信號通路通過VEGFA、NOS2、SER‐PINE1、BCL2靶點上調(diào)，影響血管新生、癌細(xì)胞遷移與凋亡[26-27]。

貓爪草被廣泛應(yīng)用于治療肺結(jié)核，相對于異煙肼、利福平毒性較小，在一定劑量下未見急性毒性[28-31]，但具體治療機(jī)制尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)貓爪草活性化合物通過STAT1、SRC、BCL2蛋白作用于肺結(jié)核、弓形蟲病、乙型肝炎等傳染病相關(guān)信號通路，起到治療傳染性疾病的作用。而已有研究證實STAT1可能成為肺結(jié)核潛在的生物標(biāo)記，SRC能有效控制感染結(jié)核病[32-33]，本研究體外實驗驗證了貓爪草給藥組A值顯著提高，200 mg/mL給藥組對結(jié)核桿菌抑制率達(dá)97%，抑制該菌生長效果顯著并呈劑量遞增，具有劑量依賴性。與陽性對照組比較，貓爪草中、高劑量組細(xì)胞水平表達(dá)顯著降低，說明貓爪草下調(diào)MMP9表達(dá)來達(dá)到抗結(jié)核桿菌的作用，前期童曄玲[16]、陳松海[15]的體內(nèi)小鼠實驗驗證MMP9、BCL2的基因表達(dá)，與本研究結(jié)果一致，證明了貓爪草同病異治的可行性與準(zhǔn)確性。

綜上所述，本研究顯示貓爪草核心化合物治療腫瘤和肺結(jié)核的“同治”作用機(jī)制，具有一定的參考價值。但部分預(yù)測到的化學(xué)成分尚未進(jìn)行深入研究，作用機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步生物學(xué)驗證。貓爪草活性成分主要涉及133個GO生物過程、14條KEGG信號通路與22個共同靶點的相應(yīng)關(guān)系，說明貓爪草具有多成分、多途徑、多靶點的特點，與中醫(yī)藥理論特點一致。