UPLC特征圖譜結合化學計量學優選炒甘草炮制工藝

徐東婷，劉路芳，黎桃敏，鄧桂海，陳偉媚，文珊，魏梅，孫冬梅

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東佛山 528244）

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草G.inflateBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖，具有清熱解毒、補脾益氣、潤肺祛痰、緩急止痛、調和諸藥的功效[1]。甘草始載于《神農本草經》，用藥歷史悠久，臨床使用頻率最高，從古至今均有大量文獻記載，有著“中藥國老”“十方九草”的美譽。甘草生品味甘，有醫家認為甘者性緩，可使脾胃運化遲緩，導致中焦脹滿，所以有“甘能令人滿”之說，而甘草經過炒制之后，借真火之氣，火性主動，從而在一定程度上防止甘草引起的中滿之弊[2]。

國家中醫藥管理局會同國家藥品監督管理局于2018年04月13日發布的《古代經典名方目錄（第一批）》中，包合甘草的處方多達60首，其中27首標注為“炙”或“炙甘草”。文獻表明，該目錄中唐代之前處方的甘草標注為“炙”的，應按清炒法進行炮制，為炒甘草[3]。2020年版《中國藥典》對甘草的炮制品只收載了蜜炙甘草的炮制方法，且文獻對于炒甘草的研究較少，炒甘草的炮制方法收錄于部分地方炮制規范，如2015年版《浙江省中藥飲片炮制規范》[4]、2008年版《上海市中藥飲片炮制規范》[5]、2005年版《河南省中藥飲片炮制規范》[6]的炮制方法均為：取凈甘草片，照清炒法炒至黃色。以上炮制方法均缺乏具體工藝參數，不利于炒甘草的質量控制。本研究通過正交試驗，以炒甘草的UPLC特征圖譜為質量評價指標，優選炒甘草飲片的炮制工藝，旨為規范炒甘草的炮制工藝提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Vanquish型高效液相色譜儀（美國Thermo公司）；XP26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE型數控超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；H22-X3型電陶爐（杭州九陽生活電器有限公司）；Milli-Q Direct型超純水系統（德國默克股份有限公司）。

1.2 試藥

甘草苷（批號：111610-201908，質量分數95.0%）、甘草酸銨（批號：110731-202021，質量分數96.2%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；芹糖甘草苷（批號：wkq19021306，質量分數>96.0%）、異甘草苷（批號：wkq18042008，質量分數>98.0%）、甘草素（批號：wkq18030505，質量分數>98.0%）對照品均購自四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈（色譜純，德國默克股份有限公司）；磷酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

甘草飲片（批號：1906015）購自馮了性藥業有限公司，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典》要求。

2 方法

2.1 炒甘草飲片制備

炒甘草飲片由本實驗室自行制備，炮制方法參考2015年版《浙江省中藥飲片炮制規范》：取甘草片，照清炒法（《中國藥典》2020年版四部通則0213）炒至黃色，晾涼。采用L9（34）正交試驗，以電炒鍋功率（A）、炒制時間（B）、翻動頻率（C）為考察因素，因素水平設計見表1。正交試驗9個試驗號樣品分別編號A1~A9。

表1 因素水平表Table 1 Factors level

2.2 炒甘草飲片特征圖譜測定方法

2.2.1 色譜條件[7]色譜柱：Thermo Acclaim RSLC 120 C18柱（100 mm×2.1 mm，2.2 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0~1 min，5%→27%A；1~2 min，27%A；2~10 min，27%→46%A；10~16 min，46%→64%A；16~24 min，64%→95%A；24~25 min，95%A）；檢測波長：237nm；流速：0.3mL/min；柱溫：30℃；進樣量：1.0 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸銨對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配制成每1 mL含芹糖甘草苷0.5 mg、甘草苷0.5 mg、異甘草苷0.8 mg、甘草素1.0 mg、甘草酸銨1.0 mg的混合對照品溶液（甘草酸質量=甘草酸銨質量/1.020 7）。

2.2.3 供試品溶液的制備 取炒甘草飲片粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%（體積分數，下同）乙醇100 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 取空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液，照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。可見，供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應的保留時間處有相同的色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗UPLC色譜圖Figure 1 UPLC fingerprints of specific test

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.2.3”項下供試品溶液，照“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以10號甘草酸色譜峰為參照峰（S），計算得到各共有峰相對保留時間的RSD<0.12%，相對峰面積的RSD<2.83%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批炒甘草飲片粉末，精密稱定，平行6份，照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以10號甘草酸色譜峰為參照峰（S），計算得到各共有峰相對保留時間的RSD<0.15%，相對峰面積的RSD<2.73%，表明方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 精密吸取“2.2.3”項下供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24 h照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以10號甘草酸色譜峰為參照峰（S），計算得到各共有峰相對保留時間的RSD<0.45%，相對峰面積的RSD<2.91%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

3 結果與分析

3.1 特征圖譜測定結果

按“2.2”項方法，測定炒甘草飲片樣品的特征圖譜，以甘草酸為參照峰，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積的RSD，結果見表2~3。可見，不同炒甘草飲片樣品特征圖譜相對保留時間的RSD范圍為0.04%~0.14%，偏差較小，相對峰面積的RSD范圍為3.15%~38.68%，偏差較大。不同炮制工藝炒甘草飲片樣品，均能呈現與對照圖譜相應的特征峰，但不同炒甘草飲片的部分特征峰峰面積之間存在較大差異，說明炮制工藝對炒甘草飲片的質量存在一定影響。9份樣品的特征圖譜疊加圖如圖2。

圖2 炒甘草UPLC特征圖譜疊加圖Figure 2 UPLC characteristic chromatograms of Fried Glycyrrhiza

表2 不同炮制工藝炒甘草樣品共有峰相對保留時間Table2 Relative retention time of common peaks of Fried Glycyrrhiza samples with different processing technology

3.2 化學模式識別分析

3.2.1 主成分分析 主成分分析法（PCA）是將多個變量通過線性變換重新組合成一組新的相互無關的綜合變量，根據實際需要從中抽取幾個盡可能多地反映原來變量信息的一種多元統計分析方法，也是數學上用來降維的一種方法[8-9]。采用SPSS 20.0軟件對9份樣品中的12個共有峰的峰面積進行降維-因子分析，主成分的特征值及貢獻率是選擇主成分的依據[10]，以特征值大于1為提取標準，得前2個成分方差的累積貢獻率為84.135%，較小，不能包括大部分的信息，故選擇前3個成分作為主成分，累積貢獻率達90.375%[11-12]，可以保留原始變量的大部分信息，特征值和方差貢獻率見表4。3個主成分因子經旋轉得到主因子載荷矩陣，見表5。結果表明，主成分因子1反映色譜峰1、2（芹糖甘草苷）、3（甘草苷）、4、6（甘草素）、7、8、10（甘草酸）的化學信息，主成分因子2可以反映色譜峰9的化學信息，主成分因子3可以反映色譜峰11的化學信息。

3.2.2 綜合評分計算 根據表4、表5的結果，并結合文獻[13-14]的方法，得到公式Fi=a1X1+a2X2+…….+ajXm（a為特征向量，由成分矩陣中的第j列載荷除以對應成分特征值的算術平方根所得，X為原始指標），計算得到F1、F2、F33個主成分的表達式，從而得到綜合評分函數（F=F1×0.750 2+F2×0.091 1+F3×0.062 4，其中F1、F2、F3為3個主成分的得分，系數為各成分的方差貢獻率）即綜合評分，然后分別計算正交試驗9組樣品的綜合評分。將樣品的峰面積進行標準化處理，結果見表6。將綜合評分輸入SPSS 20.0軟件進行正交設計分析，正交試驗安排及結果見表7，方差分析見表8。

表4 主成分因子的特征值和方差貢獻率Table 4 Characteristic value and variance percentage of prin‐cipal component factors

表5 主成分因子載荷矩陣Table 5 Main factor load matrix

表6 炒甘草飲片樣品共有峰峰面積的標準化值Table 6 Standardized value of common peak area of Fried Glycyrrhiza pieces samples

表7 炒甘草飲片炮制工藝正交設計試驗直觀分析Table 7 Orthogonal intuitionistic analysis of the processing technology of Fried Gclycyrrhiza pieces samples

由表8知，因素影響程度依次為B>A>C，即炒制時間>電炒鍋功率>翻動頻率，其中，A1>A2>A3，B1>B2>B3，C1>C3>C2，最優組合為A1B1C1。由表9知，炒制時間（B）對試驗結果的影響具有統計學意義（P<0.05），電炒鍋功率（A）和翻動頻率（C）對試驗結果的影響無統計學意義（P>0.05）。因此選擇最佳的炮制工藝為A1B1C1，即電炒鍋功率為1 000 W，炒制時間為3 min，翻動頻率為35次/min。

表8 炒甘草炮制工藝正交設計試驗方差分析Table 8 Orthogonal variance analysis of processing technology of Fried Glycyrrhiza samples

表3 不同炮制工藝炒甘草樣品共有峰相對峰面積Table 3 Relative peak area of common peaks of Fried Glycyrrhiza samples with different processing technology

3.3 驗證試驗 按照最佳炮制工藝炮制3份炒甘草飲片進行驗證，將測得的數據代入數據組中進行分析，3份得分分別為1.204、1.196、1.180，平均值為1.194，RSD為1.02%（n=3），表明選擇的炒甘草炮制工藝穩定可行。

4 討論

中藥依賴所含的多種化學成分共同發揮療效，以單指標含量作為評價標準，難以體現中藥的整體藥效。相對于傳統的經驗鑒別和單組分分析，特征圖譜由于其整體性的特征備受青睞[15]。本研究采用UPLC法對炒甘草樣品的特征圖譜進行測定，確定了12個共有峰，并利用對照品對其中5個共有峰進行了指認，可較全面地評價不同炮制工藝對炒甘草質量的影響。

主成分分析可根據實際需要提取較少的綜合變量，以盡可能反映原有變量信息，是一種科學有效的降維方法，可解決特征圖譜整體性與模糊性導致成分權重系數難以確定的弊端[16]。本研究對主成分分析所提取的3個主成分，基本反映了12個共有色譜峰的信息，通過正交試驗，計算各組PCA成分因子得分，作為綜合評分，減少了主觀因素對試驗結果的干擾，與傳統采用主觀方法為評價指標的權重系數相比，更具有科學性、客觀性與嚴謹性。

綜上，本研究確定的炒甘草最佳炮制工藝科學合理、穩定可行，可為炒甘草的產業化生產、質量控制及相關經典名方的制劑開發提供參考。