白扁豆配方顆粒質量標準研究

李素梅，畢曉黎，胥愛麗，李養學，江潔怡，張靖年，李若菲

[1.廣東省第二中醫院（廣東省中醫藥工程技術研究院）/廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東廣州 510095；2.中山大學新華學院，廣東廣州 510520]

白扁豆來源于豆科植物Dolichos lablabL.的干燥成熟種子，在我國分布廣泛，為常用藥食兩用中藥，具有健脾化濕、和中消暑的功能，主要用于治療脾胃虛弱、食欲不振、暑濕吐瀉、大便溏泄、白帶過多等[1]。白扁豆主要含有蛋白質、多糖、脂肪、鐵、鈣、磷、維生素等營養成分[2]，此外還含有甾體、苷類、葫蘆巴堿等成分[3]。研究表明，白扁豆具有抗病毒、抗菌[4]、抗氧化[5-6]、保護缺氧性神經細胞的凋亡壞死[7]、防治酒精性肝病[8]等藥理活性。《中國藥典》收載有白扁豆，其質量控制僅有性狀、橫切面顯微鑒別、水分檢查，未收載定性定量質控指標。目前，白扁豆質量控制研究方面的文獻相對較少，僅有白扁豆總磷脂含量測定[9]和白扁豆中哌林可酸定性定量研究的報道[10]。

白扁豆配方顆粒是由合格的白扁豆飲片經提取、濃縮等現代制劑工藝制備而成的可供臨床直接配方使用的顆粒劑[11]。目前，不同生產企業白扁豆配方顆粒質量標準參差不齊，無統一的標準，多為性狀、浸出物等質控指標，缺少定性和含量測定指標，導致臨床療效不能保證。因此，建立白扁豆配方顆粒定性、定量質量控制方法顯得十分必要。葫蘆巴堿是白扁豆中所含的兩性季銨鹽類生物堿，具有降血糖、抗腫瘤、降血脂[12-16]、抗感染、抗菌、鎮痛等活性[17]。葫蘆巴堿藥理活性與白扁豆藥理活性具有一定的相似性，本研究選擇其為白扁豆配方顆粒質量控制指標，采用白扁豆對照藥材和葫蘆巴堿隨行對照，建立白扁豆配方顆粒薄層色譜定性鑒別方法，采用高效液相色譜法測定白扁豆配方顆粒中葫蘆巴堿的質量分數，旨在為白扁豆質量標準的制訂提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

KQ-700DE超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司）；澳華HH-2恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；DH-9203恒溫電熱烘箱（上海精密實驗設備有限公司）；ATS4卡瑪自動點樣機（瑞士卡瑪公司）；卡瑪成像系統（瑞士卡瑪公司）；TLE-204萬分之一、Mettler XS 205 DU十萬分之一梅特勒電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；1200安捷倫液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）。

1.2 試藥

白扁豆對照藥材（批號：AF 00120351）購自成都埃法生物科技有限公司；葫蘆巴堿（批號：H-057-180110，質量分數：98%）購于成都瑞芬思生物科技有限公司；白扁豆配方顆粒10批：批號8060101（編號S1）、批號0062471（編號S2）、批號0093521（編號S3）、批號9041951（編號S4）、批號0072761（編號S5）、批號0091501（編號S6）、批號9072151（編號S7）、批號9120761（編號S8）、批號0122231（編號S9）、批號9024401（編號S10），均由廣東一方制藥有限公司提供；乙腈為Merck色譜純試劑，液相用水為屈臣氏水，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 白扁豆配方顆粒定性鑒別

2.1.1 定性鑒別方法Ⅰ取白扁豆配方顆粒0.5 g，研細，加入70%（體積分數，下同）乙醇30 mL，超聲處理提取30 min，提取液蒸干，殘渣加70%乙醇1 mL溶解，制得供試品溶液。另取白扁豆對照藥材1.00 g，置250 mL燒杯中，加100 mL水，加熱煎煮使之保持微沸30 min，放冷后濾過，濾液置水浴鍋上蒸至剩約5 mL，用適量硅藻土吸附，蒸干并轉移至錐形瓶中，自“加入70%乙醇30 mL”起，同法制得白扁豆對照藥材溶液。按照《中國藥典》四部通則0502項下薄層色譜法操作，吸取上述供試品溶液2 μL、白扁豆對照藥材溶液4 μL，分別點樣在同一硅膠G薄層板，以正丁醇-冰醋酸-水（體積比19∶5∶5）作為展開劑[1]，展開，取出晾干后，以茚三酮試液為顯色劑，在105℃烘箱中加熱使斑點顯色清晰，結果見圖1。可見，供試品色譜中，在與白扁豆對照藥材色譜相同Rf值位置處，顯相同顏色的斑點，10批配方顆粒TLC鑒別均可檢出對應斑點。

圖1 10批白扁豆配方顆粒薄層鑒別圖Figure 1 TLC of ten batches of Lablab Semen Album granules

2.1.2 定性鑒別方法Ⅱ 取白扁豆配方顆粒0.20 g，研細，加30 mL甲醇，超聲處理提取30 min，提取液蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解，制得供試品溶液。另取白扁豆對照藥材2.00 g，加30 mL甲醇，同法制得白扁豆對照藥材溶液。再取葫蘆巴堿對照品適量，加甲醇制成質量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。

按照《中國藥典》四部通則0502項下薄層色譜法操作，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于在同一硅膠GF254薄層板上，以正丁醇-甲醇-水（體積比4∶2∶4）作為展開劑展開，取出晾干后，在波長為254 mm的紫外光燈下檢視，結果見圖2。可見，供試品色譜中，在與白扁豆對照藥材和葫蘆巴堿對照品色譜相同Rf值位置處，顯相同顏色的斑點，10批配方顆粒TLC鑒別均可檢出對應斑點。

圖2 10批白扁豆配方顆粒葫蘆巴堿薄層鑒別圖Figure 2 TLC of ten batches of Trigonelline of Lablab Semen Album granules

2.2 葫蘆巴堿質量分數的測定

2.2.1 色譜條件 以GRACE Econosphere Amino柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，柱溫為25℃，以乙腈-水（體積比80∶20）為流動相[18-19]，流速為1 mL/min，檢測波長為265 nm。

2.2.2 葫蘆巴堿對照品儲備液的配制 精密稱取葫蘆巴堿對照品5.24 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋定容至刻度線，制成質量濃度為0.205 4 mg/mL的對照品儲備液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取白扁豆配方顆粒適量，研細，取約0.2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加25 mL 70%甲醇溶液為提取溶劑，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min，取出放冷后，補足質量，搖勻并濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 專屬性試驗 分別取空白溶劑、葫蘆巴堿對照品溶液、供試品溶液，進樣10 μL，按照“2.2.1”項色譜條件測定，采集色譜圖，結果見圖3。可見，空白溶劑對葫蘆巴堿的測定無干擾，具有較好的專屬性。

圖3 白扁豆配方顆粒葫蘆巴堿測定的HPLC圖Figure 3 HPLC of content of trigonelline in Lablab Semen Album granules.

2.2.4.2 葫蘆巴堿線性考察 取“2.2.2”項的葫蘆巴堿對照品儲備液，分別精密吸取1、1.5、2.5、5、7.5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即制得質量濃度分別為20.54、30.81、51.35、102.7、154.05 μg/mL的對照品溶液，分別精密吸取已配制的對照品溶液及對照品儲備液（0.205 4 mg/mL）各10 μL，進樣，按照“2.2.1”項色譜條件測定并記錄峰面積，以葫蘆巴堿峰面積為縱坐標（Y）、葫蘆巴堿進樣的量（μg）為橫坐標（X）進行回歸，得回歸方程Y=1 426.212 79X+2.651 1497（r=1.000 0），結果表明葫蘆巴堿進樣量在0.205 4～2.054 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

2.2.4.3 精密度試驗 精密吸取白扁豆配方顆粒（S1）供試品溶液10 μL，連續進樣6次，按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積并計算RSD，結果葫蘆巴堿色譜峰峰面積RSD值為0.47%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.4 穩定性試驗 精密吸取白扁豆配方顆粒（S1）供試品溶液10 μL，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進樣測定峰面積并計算RSD，結果葫蘆巴堿色譜峰峰面積RSD值為0.48%，表明供試品溶液在12 h內穩定性較好。

2.2.4.5 重復性試驗 取白扁豆配方顆粒（S1），研細，取約0.2 g，精密稱定質量，按“2.2.3”項方法平行處理6份，按“2.2.1”項色譜條件測定峰面積并計算質量分數，結果葫蘆巴堿平均質量分數為10.00 mg/g，RSD值為0.36%，表明方法重復性較好。

2.2.4.6 中間精密度試驗 由實驗室其他工作人員，在不同時間和儀器上操作，取白扁豆配方顆粒（S1），按“2.2.3”項方法平行處理6份供試品溶液，再按“2.2.1”項色譜條件測定，結果葫蘆巴堿色譜峰峰面積RSD值為1.42%，表明方法中間精密度良好。

2.2.4.7 加樣回收率試驗 精密稱取葫蘆巴堿對照品12.78 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋定容至刻度線，制得質量濃度為0.250 5 mg/mL的對照品溶液；再取9個規格為100 mL的具塞錐形瓶，編號1～9號，其中1～3號錐形瓶各分別精密加入2 mL對照品溶液，4～6號錐形瓶各分別精密加入4 mL對照品溶液，7～9號錐形瓶各分別精密加入6 mL對照品溶液，置氮吹儀上吹干溶劑后，再取S1（8060101）白扁豆配方顆粒，研細，取約0.1 g，9份，精密稱定，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項色譜條件測定，計算回收率，結果測得平均回收率為103.38%（n=9），RSD為0.98%，表明方法回收率良好，結果見表1。

表1 葫蘆巴堿加樣回收率試驗結果Table 1 Recovery results of trigonelline(n=9)

2.2.5 白扁豆配方顆粒樣品質量分數的測定 取S1～S10白扁豆配方顆粒，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項色譜條件測定，10批白扁豆配方顆粒葫蘆巴堿質量分數測定結果見表2。可見，10批次白扁豆配方顆粒葫蘆巴堿平均質量分數為9.38 mg/g，后續將繼續收集多批次樣品進行測定，再根據測定結果擬定白扁豆配方顆粒中葫蘆巴堿含量限度。

表2 10批次白扁豆配方顆粒葫蘆巴堿質量分數測定結果Table 2 Results of content of trigonelline in ten batches of Lablab Semen Album granules(n=2)

3 討論

白扁豆配方顆粒對照藥材定性鑒別主要針對氨基酸類成分進行鑒別，參考了2020年版《中國藥典》一部大豆黃卷鑒別項下亮氨酸鑒別的展開劑及顯色條件，以正丁醇-冰醋酸-水（體積比19∶5∶5）為展開劑，展開晾干后，以茚三酮試液為顯色劑，在105℃加熱，結果顯示供試品色譜與白扁豆對照藥材色譜斑點對應良好。葫蘆巴堿薄層色譜鑒別過程中，因葫蘆巴堿為兩性季銨鹽類生物堿，極性較大，展開劑選擇方面往極性大的展開系統考慮，曾嘗試了無水乙醇-丙酮-鹽酸（體積比5∶3∶0.5）展開劑，但是展開效果不好，經摸索調整為正丁醇-甲醇-水系統，比例為正丁醇-甲醇-水（體積比4∶1∶4）時，葫蘆巴堿斑點Rf值較低，經調整為正丁醇-甲醇-水（體積比4∶2∶4），斑點Rf值適中，斑點對應良好；另外，葫蘆巴堿在265 nm下有最大紫外吸收，故采用GF254板為固定相、254 nm為檢視波長，可較好地鑒別葫蘆巴堿斑點。另外，對所建立的薄層色譜鑒別方法進行了耐用性考察，分別考察了自制硅膠G薄層板/自制硅膠GF254薄層板和默克硅膠G預制板（批號：MX98383926）/默克硅膠GF254預制板（批號：MC41365054）、不同溫度（25℃、4℃）、不同濕度（25%、75%）條件下的展開情況，結果顯示所建方法耐用性均較好。

白扁豆配方顆粒葫蘆巴堿質量分數測定方法研究建立過程中，因葫蘆巴堿極性較強，在一般C18反相柱上吸附較弱，導致出峰較早，故選擇氨基鍵合柱進行分析。供試品溶液的制備分別考察了不同提取溶劑（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、20%甲醇）、不同提取方式（超聲、加熱回流）、提取溶劑料液比（1∶1、1∶2）、提取時間（15、30、45 min）的葫蘆巴堿提取效果，結果以70%甲醇25 mL為提取溶劑、超聲處理30 min的提取效果較好。另外，分別考察了不同廠牌色譜柱（Phenomenex Luna NH2柱、GRACE Econosphere Amino柱、Waters Xbridge Amide柱）、以及不用柱溫（20、25、30℃）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）等色譜耐用性影響因素，綜合考慮色譜峰峰形、分離度、壓力、分析時間等因素，確定最終色譜條件。

本研究建立的白扁豆配方顆粒的定性與定量方法簡便可行、重復性好、準確可靠，可為白扁豆配方顆粒質量標準的制訂或標準提高及質量控制提供參考。