白芷乙素對潰瘍性結腸炎小鼠的影響

宋少華，李海艦，李莉娟，方曉琳

（廣東省第二人民醫院檢驗醫學部，廣東廣州 510317）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis,UC）是一種比較常見的炎癥性疾病，臨床上UC患者常表現為腹脹、腹痛、腹瀉、便血以及炎癥等，嚴重影響UC患者的身體健康[1]。目前，對UC病因的探究尚不完全清楚，其與機體生理、遺傳因素、環境和心理變化等均關系密切[2]。目前，臨床上常用于治療UC的藥物主要包括柳氮磺吡啶、氨基水楊酸、糖皮質類激素和免疫抑制劑等，雖然其短期對UC患者的癥狀改善有益，但如長期應用或大劑量應用則可引起多種不良反應的發生[3]。近些年來，越來越多的中藥有效成分對UC的治療展現出良好的效果[4]，其對抗UC新藥的挖掘具有較好的啟發作用。針對目前開發抗UC新藥的需要仍迫在眉睫，從中藥尋找抗UC新藥是一種可行的新方法。

白芷是傘形科植物杭白芷或白芷的干燥根，具有祛風止痛、解表散寒、消腫排膿、燥濕止帶以及宣通鼻竅的功效[5]。白芷乙素是白芷植物中一種呋喃香豆素類活性成分，其抗炎、抗氧化、保護心血管和抗凋亡等新的藥理作用已逐漸被發現[6]。已有研究報道白芷可通過降低IL-1β水平，升高IL-10水平，以及下調NF-κB蛋白活性，從而改善UC大鼠的癥狀[7]。此外，臨床研究報道茵陳白芷湯治療慢性結腸炎濕熱內蘊型39例取得較好的效果[8]。但是白芷乙素對UC是否有防治作用目前未見研究報道。基于前期本課題組預實驗初步篩查發現白芷乙素對UC小鼠具有明顯的癥狀改善作用，本實驗通過構建急性UC小鼠模型，探討白芷乙素對小鼠UC的作用及其機制，以期為日后抗UC新藥開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

白芷乙素（質量分數≥98%，上海晨易生物科技有限公司，批號：20190205）；TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 ELISA檢測試劑盒（博士德生物技術有限公司，批號分別為23913119104、42574412547、32565248754、65487547821）；SOD和MDA檢測試劑盒（南京建成生物有限公司，批號分別為20210412、20210324）；TLR4和NF-κBp65單克隆抗體（abcam公司，批號分別為HM2298、CH4257）。

1.2 動物分組與給藥

2月齡雄性SPF級C57BL/6小鼠60只，體質量18~22 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXX（湘）2018-0003。動物適應性喂養7 d后開始本實驗。將小鼠按體質量隨機分為空白對照組、模型組、柳氮磺胺吡啶組（LD組：0.5 g/kg）、白芷乙素低劑量組（BZ-L：6 mg/kg）、白芷乙素中劑量組（BZ-M：12 mg/kg）和白芷乙素高劑量組（BZ-H：24 mg/kg），每組10只。建模當天灌胃給藥，連續7 d，空白對照組和模型組灌胃等量生理鹽水。

1.3 潰瘍性結腸炎模型構建

參照文獻[9]方法構建小鼠UC模型，具體方法如下：小鼠連續自由飲用3%DSS水溶液7 d，其中每隔1天更換新配的DSS溶液。空白對照組飲用正常水。

1.4 疾病活動指數（DAI）評分

實驗過程中每日觀察各組小鼠的行為學，觀察大便的性狀、便血等，主要參照文獻[10]方法對各組小鼠進行DAI評分，詳見表1。

表1 DAI評分標準Table 1 Scoring criteria of DAI

1.5 結腸組織形態損傷評分

本實驗第7天結束后，采用頸椎脫臼方式處死小鼠，剖開動物腹腔，小心取出小鼠結腸部，并縱向剪開結腸，觀察結腸組織大體的形態學變化，并按表2的評分標準對動物進行評分[11]。

表2 結腸組織形態損傷評分標準Table 2 Scoring criteria of morphological injury of colon tissue

1.6 結腸組織病理學觀察

實驗結束后，小心切取各組小鼠統一部位的結腸組織，10%（φ）中性甲醛浸泡72 h后，按以下步驟進行石蠟包埋切片以及HE染色，石蠟包埋步驟：流水沖洗結腸組織過夜，70%（φ）酒精浸泡24 h，80%酒精浸泡24 h，95%酒精浸泡6 h，100%酒精浸泡3 h，二甲苯浸泡5 min，石蠟浸泡3 h后，進行石蠟包埋及切片（厚度為5 μm）。HE染色步驟：二甲苯浸泡2次，5 min/次，100%酒精浸泡5 min，95%酒精浸泡5 min，70%酒精浸泡5 min，蒸餾水浸泡5 min，蘇木素染液浸泡5 min，伊紅染液浸泡15 s，晾干后，封片，鏡檢。

1.7 結腸組織炎癥因子指標檢測

按質量（結腸組織）∶體積（生理鹽水）比=1∶9制備結腸組織勻漿，準確稱取結腸組織，加入9倍體積生理鹽水，使用玻璃勻漿器于4℃冰上研磨，4℃，4 000 r/min離心15 min，分離上清，置于?80℃冰箱保存備用。采用ELISA試劑盒檢測結腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的水平。

1.8 結腸組織氧化應激指標檢測

結腸組織勻漿制備同“1.7”，按檢測試劑盒說明書步驟檢測結腸組織SOD活性以及MDA水平。

1.9 結腸組織TLR4和NF-κB p65蛋白表達水平檢測

結腸組織勻漿制備同“1.7”，隨后100℃水浴加熱變性蛋白，測定蛋白濃度。每孔上樣40 μg蛋白，常規電泳分離和轉PVDF膜，5%BSA封閉液封閉2 h，分別使用的TLR4（1∶2 000）、NF-κB p65（1∶2 000）、β-actin抗體（1∶2 000）4℃孵育過夜和山羊抗兔IgG抗體（1∶3 000）室溫孵育2 h，PBST清洗5次，5 min/次，滴加200 μL顯影劑后，使用凝膠成像系統成像。

1.10 統計學方法

使用SPSS 19.0軟件對數據進行統計學分析。多組間均數比較采用單因素方差分析和LSD檢驗，計量資料用表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況觀察

實驗前各組小鼠均無異常表現。模型組小鼠造模后第2天糞便開始出現異常，并逐漸變軟和稀，第5天出現肉眼可見的血便現象和肛門出血。經給藥治療后，小鼠以上癥狀有比較明顯的改善，其中BZ-H組和LD組改善作用最優。

2.2 各組小鼠DAI評分

與空白對照組比較，模型組的DAI評分明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組的DAI評分明顯降低（P<0.05），其中BZ-H組和LD組DAI評分改善效果最優，見表3。

表3 各組小鼠DAI評分結果Table 3 DAI score of mice in each group(xˉ±s,n=10)

2.3 各組小鼠結腸組織形態損傷評分

與空白對照組比較，模型組的結腸組織形態損傷評分明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組的結腸組織形態損傷評分則明顯降低（P<0.05），其中BZ-H組和LD組結腸組織形態損傷評分改善效果最好，詳見表4。

表4 各組小鼠結腸組織形態損傷評分結果Table 4 Morphological injury score of colon tissue of mice in each group(±s,n=10)

表4 各組小鼠結腸組織形態損傷評分結果Table 4 Morphological injury score of colon tissue of mice in each group(±s,n=10)

與空白對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

組別空白對照組模型組LD組BZ-L組BZ-M組BZ-H組分數0.00±0.00 4.36±0.68**2.65±0.57##3.76±0.78#3.23±0.45#2.55±0.76##

2.4 各組小鼠結腸組織病理學觀察

空白對照組小鼠結腸黏膜上皮排列整齊，結腸絨毛完整，結腸腸腺多種細胞排列整齊，未炎癥細胞浸潤。模型組小鼠腸絨毛破損嚴重，有脫落壞死，大部分腸腺出現壞死和溶解，可見大量炎性細胞浸潤。給予藥物后，以上損傷出現不同程度的改善，結腸黏膜結構分層比較清晰，結腸腸腺細胞排列比較整齊，炎性細胞數量明顯減少，其中BZ-H組和LD組結腸組織病理變化改善最優，見圖1。

圖1 各組小鼠結腸組織病理學變化（HE染色，200×）Figure 1 Histopathological changes of colon tissue of mice in each group(HE staining,200×)

2.5 各組小鼠結腸組織炎癥因子水平比較

與空白對照組比較，模型組小鼠結腸組織中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯升高（P<0.01），而抑炎因子IL-10的水平明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯降低（P<0.05），而抑炎因子IL-10水平則明顯升高（P<0.05），其中BZ-H組和LD組改善效果最優，見圖2。

圖2 各組小鼠結腸組織炎癥因子水平Figure 2 Levels of inflammatory factors in colonic tissue of mice in each group(xˉ±s,n=10)

2.6 各組小鼠結腸組織SOD活性和MDA水平

與空白對照組比較，模型組結腸組織SOD活性明顯降低（P<0.01），而MDA水平明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組的SOD活性明顯升高（P<0.01），而MDA水平明顯降低（P<0.05），其中BZ-H組和LD組改善效果最好，見圖3。

圖3 各組小鼠結腸組織SOD活性和MDA水平Figure 3 SOD activity and MDA level in colon tissue of mice in each group(xˉ±s,n=10)

2.7 結腸組織TLR4和NF-κBp65蛋白表達水平

與空白對照組比較，模型組結腸組織的TLR4和NF-κB p65的蛋白表達量明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組結腸組織的TLR4和NF-κB p65的蛋白表達量明顯降低（P<0.05），其中BZ-H組和LD組改善效果最好，見圖4。

圖4 各組結腸組織TLR4和NF-κB p65蛋白表達水平Figure 4 Expression TLR4 and NF-κB p65 in colon tissues of mice in each group(xˉ±s,n=10)

3 討論

UC是一種慢性非特異性炎癥性的腸道疾病，UC患者經常出現腹痛、黏液便和排膿血便等癥狀，目前，其發病機制尚不得知，可能是由于外部環境引起宿主的免疫反應和基因改變等[12]。柳氮磺吡啶在臨床上常用于治療UC的常用藥物，但長期使用多種嚴重副作用，如中性粒細胞缺乏、藥疹和剝脫性皮炎等[13]，故抗UC新藥的開發仍是目前極為重要的任務之一。

本實驗通過自由飲用3%DSS溶液構建小鼠UC模型，觀察白芷乙素抗UC的作用效果。本研究發現，白芷乙素各劑量組均能明顯改善UC小鼠癥狀，如降低DAI評分，減輕結腸組織損傷以及減少結腸組織炎癥細胞的浸潤，其中BZ-H組的改善效果最優。在炎癥發展過程中，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10作為重要的細胞因子參與到多種的炎癥信號通路中。其中TNF-α和IL-1β常用于評價機體炎癥嚴重程度的重要指標[14]。IL-1β參與了UC患者的免疫應答反應，而TNF-α參與了UC患者結腸黏膜損傷[15]，兩者與UC的發生發展密切相關。IL-10是一種重要的炎癥抑制因子，其可通過抑制機體多種炎癥因子的合成，如TNF-α、IL-1β、IL-6等[16]，調節機體的炎癥反應。此外，IL-10還可調節機體腸道細胞的免疫平衡，維持正常腸道黏膜微生態平衡[17]。SOD活性和MDA水平是反映機體氧化損傷嚴重程度的重要指標[18]。本研究發現白芷乙素能夠顯著降低UC小鼠結腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平，升高結腸組織IL-10水平和SOD活性，改善UC小鼠的炎癥和氧化損傷。

NF-κB是UC炎癥過程得以持續發展的重要指標，其通過促進多種致病因子表達和釋放[19]，如TNF-α、IL-1β、IL-6引起機體產生級聯效應的炎癥反應，使炎癥過程持續放大，進一步導致腸黏膜損傷，引導UC的發生發展[20]。本研究發現，白芷乙素各劑量組可明顯降低UC小鼠結腸組織中TLR4和NF-κB p65蛋白表達水平，提示白芷乙素可抑制UC小鼠TLR4/NF-κB p65信號通路，這可能是其抗UC的重要作用機制。

綜上所述，白芷乙素對DSS誘導的UC小鼠具有一定的保護作用，其機制可能與抑制炎癥、抗氧化損傷以及調節TLR/NF-κB信號通路有關。本研究為抗UC新藥研發提供了實驗依據。