扶正抑瘤湯含藥血清對骨肉瘤MG-63細胞生長和侵襲的影響

朱知梅，唐鳳，蔡恒，王常清，張曉越

（1.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院中藥房，湖北恩施 445000；2.甘肅省慶陽市人民醫(yī)院骨一科，甘肅慶陽 745000）

骨肉瘤是一種源于間葉組織的惡性骨腫瘤，多發(fā)于青少年或兒童，臨床大多表現(xiàn)為疼痛、腫塊、跛行等[1]。目前，骨肉瘤的發(fā)病機制尚不明確，臨床主要采用外科手術(shù)治療切除病灶組織，聯(lián)合新輔助化療來降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，取得了一定的治療效果[2]。但化療藥物在殺滅腫瘤細胞的同時，常伴隨明顯的全身性毒副作用，部分患者常因無法耐受化療副作用，而被迫中止化療，嚴重影響了化療的療效[3]。分析骨肉瘤的發(fā)病機制，尋找安全有效的治療藥物輔助臨床治療，降低化療的毒副作用，受到了研究者們的廣泛關(guān)注。扶正抑瘤湯（Fuzheng Yiliu decoction,FYD）屬于中醫(yī)組方，方中包含當(dāng)歸、紅芪、莪術(shù)、墓頭回4種中藥，具有扶正固本、益氣補血、散痞祛邪等功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示[4]，F(xiàn)YD可以提高機體免疫力，改善血液循環(huán)，發(fā)揮抗炎、抗腫瘤的作用，目前已逐步應(yīng)用于臨床抗腫瘤的輔助治療。但FYD對骨肉瘤的作用及可能的機制尚不清楚。因此，本研究探討了FYD對骨肉瘤細胞生長和侵襲的作用，旨在為FYD在骨肉瘤治療中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多功能酶標檢測儀（iMark680），購自Bio-Rad公司；光學(xué)顯微鏡（BX60型），購自日本Olympus公司；FACScan流式細胞儀，購自美國FranklinLakes；MG-63細胞，購自中科院上海細胞庫；FYD方中紅芪、當(dāng)歸、莪術(shù)、墓頭回，均購自甘肅藥材公司（批號130712）；CCK-8檢測試劑盒、Transwell小室（基質(zhì)膠），購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；JC-1熒光探針，購自艾美捷科技有限公司；兔抗人血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、波形蛋白（vimentin）、纖連蛋白（fibronectin）、Bcl-2相關(guān)X蛋白/B細胞淋巴瘤2（Bcl-2 associated X protein/B-cell lymphoma 2，Bax/Bcl-2）、原癌基因c-Myc抗體，均購于美國Santa Cruz公司；β-actin和辣根過氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗兔IgG，購于丹麥DAKO公司。

SD雄性大鼠40只，SPF級，6~8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2017-0022。

1.2 FYD含藥血清的制備

大鼠預(yù)飼養(yǎng)7 d后，將40只SD大鼠隨機分為對照組和FYD低、中、高劑量組，各組10只。FYD方中當(dāng)歸、紅芪、莪術(shù)、墓頭回按質(zhì)量比1∶3∶1∶3加3倍體積的水煎煮，過濾，常壓加熱濃縮至2 g/mL，于4℃冰箱備用。FYD低、中、高劑量組分別灌胃劑量為7.5、15、30 g/kg的FYD，對照組灌胃等體積生理鹽水，2次/d，連續(xù)灌胃3 d。末次給藥1 h后，麻醉大鼠，無菌分離各組大鼠的腹主動脈血液，離心（3 000 r/min，10 min），取上清，56℃水浴鍋滅活補體30 min，經(jīng)0.22 μm濾菌膜過濾除菌，置于?80℃冰箱備用。

1.3 細胞培養(yǎng)及分組

將MG-63細胞接種于含10%（φ）血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待細胞生長密度達到80%時，進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，設(shè)置對照組和FYD低、中、高劑量組。對照組細胞加入含10%對照組大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基；FYD低、中、高劑量組細胞分別加入含有10%FYD低、中、高劑量組大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃5%（φ）CO2條件下培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實驗研究。

1.4 CCK-8法檢測MG-63細胞增殖

取各組對數(shù)生長期細胞與含相應(yīng)濃度藥物血清孵育24 h后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d，加入10 μL CCK8，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標儀測定各孔在波長為450 nm時的吸光度值（A450），計算細胞增殖活性=（A實驗孔?A空白孔）/（A初始?A空白孔）。

1.5 克隆形成實驗檢測MG-63細胞的克隆形成率

取各組對數(shù)生長期細胞與含相應(yīng)濃度藥物血清孵育24 h后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，至大多數(shù)單個克隆中細胞數(shù)大于50，每孔加入質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛，在室溫下固定10 min，隨后加入質(zhì)量分數(shù)為1%的結(jié)晶紫進行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察每孔內(nèi)細胞的克隆形成數(shù)，計算克隆形成率。

1.6 Transwell檢測MG-63細胞的侵襲力

取各組對數(shù)生長期細胞與含相應(yīng)濃度藥物血清孵育24 h后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，調(diào)整細胞濃度為2×105個/mL。取100 μL稀釋好的細胞懸液加于Transwell上室，下室為完全培養(yǎng)基，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，取出Transwell小室，采用Hemacolor Kit試劑盒進行固定和染色，顯微鏡下計數(shù)膜下室面表面的細胞數(shù)即侵襲細胞數(shù)。

1.7 流式細胞儀檢測MG-63細胞的線粒體膜電位

取各組對數(shù)生長期細胞與含相應(yīng)濃度藥物血清孵育24 h后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，離心（1 000 r/min，10 min），加入1 mmol/L的JC-1染色工作溶液1 mL，37℃下孵育30 min，上流式細胞儀檢測各組細胞的熒光強度。

1.8 Western blot檢測VEGF、vimentin、fibronectin、Bax/Bcl-2、caspase-3、c-Myc的表達

取各組對數(shù)生長期細胞與含相應(yīng)濃度藥物血清孵育24 h后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用細胞裂解液提取總蛋白并進行蛋白定量，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加一抗（VEGF、vimentin、fibronectin、Bax/Bcl-2、caspase-3、c-Myc，稀釋比例均為1∶1 000）4℃孵育過夜，洗膜加二抗（稀釋比例為1∶5 000）室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光顯影，β-actin作為內(nèi)參，分析對比條帶強弱。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，滿足正態(tài)分布計量資料均以均數(shù)±標準差（）表示，采用單因素方差分析比較組間差異，SNK-q比較3組兩兩間差異性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FYD對MG-63細胞增殖的影響

見圖1。CCK-8結(jié)果顯示，與對照組比較，中高劑量FYD組MG-63細胞的增殖活性明顯降低（P<0.05），且隨著FYD劑量增加，其作用明顯增加（P<0.05）。

圖1 FYD對MG-63細胞增殖的影響Figure 1 Effect of FYD on MG-63 cell proliferation

2.2 FYD對MG-63細胞克隆形成的影響

見圖2。克隆形成試驗結(jié)果顯示，與對照組比較，中高劑量FYD組MG-63細胞的克隆形成率明顯降低（P<0.05），且隨著FYD劑量增加，其作用明顯增加（P<0.05）。

圖2 FYD對MG-63細胞克隆形成的影響（40×）Figure 2 Effect of FYD on MG-63 cell clone formation（40×）

2.3 FYD對MG-63細胞侵襲的影響

Transwell檢測結(jié)果顯示（見圖3）。與對照組比較，中高劑量FYD組MG-63細胞的侵襲細胞數(shù)明顯下降（P<0.05），且隨著FYD劑量增加，其作用明顯增加（P<0.05）。

圖3 FYD對MG-63細胞侵襲的影響Figure 3 Effectof FYD on MG-63 cell invasion

2.4 FYD對MG-63細胞VEGF、vimentin、fibronectin蛋白表達的影響

見圖4。Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，中高劑量FYD組MG-63細胞VEGF、vimentin、fibronectin蛋白表達明顯下降（P<0.05），且隨著FYD劑量增加，其作用明顯增加（P<0.05）。

圖4 FYD對MG-63細胞VEGF、vimentin、fibronectin蛋白表達的影響Figure 4 Effects of FYD on the expression of VEGF，vimentin and fibronectin in MG-63 cells

2.5 FYD對MG-63細胞線粒體膜電位的影響

見圖5。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，中高劑量FYD組MG-63細胞線粒體膜電位明顯下降（P<0.05），且隨著FYD劑量增加，其作用明顯增加（P<0.05）。

圖5 FYD對MG-63細胞線粒體膜電位的影響Figure 5 Effect of FYD on mitochondrial membrane potential of MG-63 cells

2.6 FYD對MG-63細胞線粒體損傷標記物Bax/Bcl-2、caspase-3、c-Myc蛋白表達

結(jié)果見圖6。Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，中高劑量FYD組Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3/caspase-3蛋白表達明顯升高（P<0.05），c-Myc蛋白表達明顯下降（P<0.05），且隨著FYD劑量增加，其作用明顯增加（P<0.05）。

圖6 FYD對MG-63細胞Bax/Bcl-2、caspase-3、c-Myc蛋白表達Figure 6 Effect of FYD onthe expression ofBax/Bcl-2，caspase-3 and c-myc in MG-63 cells

3 討論

骨肉瘤是一種較常見的惡性骨腫瘤，臨床主要采用手術(shù)聯(lián)合化療治療，治療后的5年生存率可達70%左右[5]。然而多項研究顯示[6]，化療藥物的毒副作用明顯，且長期應(yīng)用可誘導(dǎo)出現(xiàn)化療耐藥性，嚴重影響了骨肉瘤患者的治療效果。FYD方中包含當(dāng)歸、紅芪、莪術(shù)、墓頭回，其中當(dāng)歸有補血活血、通經(jīng)活絡(luò)、潤腸通便等功效，紅芪有補氣固表、利水消腫、斂瘡生肌等功效，兩者聯(lián)用可以補益氣血、活血化淤；莪術(shù)有行氣解郁、活血止痛等功效，墓頭回性涼，有解毒、收澀止血、清熱燥濕等功效，兩者聯(lián)用可以清熱解毒、活血化疲，四藥聯(lián)用可達扶正固本、清熱解毒、散痞祛邪之效。現(xiàn)代藥理學(xué)顯示[7]，F(xiàn)YD方中當(dāng)歸、紅芪、莪術(shù)、墓頭回等藥具有抗腫瘤作用，提示FYD有望應(yīng)用于臨床骨肉瘤的抗腫瘤。但目前FYD對骨肉瘤的作用及具體機制尚不明確。因此，本研究觀察了中藥組方FYD對骨肉瘤細胞生長和侵襲的影響，發(fā)現(xiàn)FYD可以以劑量依賴性的方式抑制MG-63細胞的增殖活性，說明FYD可以抑制骨肉瘤細胞的增殖。

本研究中，F(xiàn)YD抑制MG-63細胞侵襲，抑制VEGF、vimentin、fibronectin蛋白表達呈劑量依賴性。VEGF是細胞內(nèi)促血管生成因子，可促進腫瘤細胞血管的新生，為腫瘤細胞的增殖提供豐富的影響，為細胞侵襲和遷移提供新的通道[8]。vimentin主要表達于間充質(zhì)細胞，是細胞骨架的組成成分，可調(diào)節(jié)細胞的粘附功能，其陽性表達是細胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)換的標志[9]。fibronectin是一種高分子糖蛋白，可調(diào)節(jié)細胞間的黏附作用，促進腫瘤細胞的侵襲和遷移[10]。Piera-Velazquez等[11]的 研 究 顯 示，VEGF、vimentin、fibronectin異常高表達是細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)換的標志，也是細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，提示FYD可以抑制侵襲相關(guān)蛋白表達，抑制骨肉瘤細胞侵襲。陳春蘭等[12]研究顯示，VEGF基因沉默可以明顯抑制人血管瘤內(nèi)皮細胞vimentin蛋白表達，抑制細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，抑制細胞侵襲，提示FYD可能通過抑制VEGF蛋白表達，抑制骨肉瘤細胞黏附相關(guān)蛋白表達，抑制細胞侵襲。

本研究中，F(xiàn)YD可以劑量依賴性的方式降低MG-63細胞線粒體膜電位。研究顯示[13]，線粒體膜電位降低可以影響線粒體內(nèi)ATP的合成，影響細胞內(nèi)的能量代謝，影響細胞的增殖、分化、凋亡等多種病理生理過程，提示FYD可以呈劑量依賴性的調(diào)節(jié)線粒體膜電位，影響細胞的生物學(xué)行為。本研究中，F(xiàn)YD可以劑量依賴性的方式促進MG-63細胞Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3/caspase-3蛋 白 表 達，抑制c-Myc蛋白表達。c-Myc是一種具有多種調(diào)控作用的癌基因，可以參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[14]。Bax/Bcl-2是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要蛋白，在多種因素刺激下可誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位至細胞膜，破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)細胞色素C釋放，激活caspase-3，降解細胞內(nèi)多種重要蛋白，誘導(dǎo)細胞凋亡[15]。張小方等[16]研究顯示，c-Myc基因干擾可以抑制腎癌細胞增殖，促進細胞凋亡，抑制移植瘤組織生長。Liang等[17]研究顯示，c-Myc基因可以調(diào)節(jié)kras介導(dǎo)的線粒體功能障礙，調(diào)節(jié)胰腺癌細胞的生物學(xué)行為。孟祥武等[18]研究顯示，VEGF作用可以促進侵襲相關(guān)蛋白和c-Myc蛋白表達，促進腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為，提示FYD可能通過抑制VEGF蛋白表達，調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞的侵襲和線粒體損傷，但其具體的機制尚需進一步深入研究。

綜上所述，F(xiàn)YD可以呈劑量依賴性的抑制MG-63細胞的生長和侵襲，誘導(dǎo)線粒體損傷，誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡，其作用機制可能與抑制VEGF蛋白表達有關(guān)，有望應(yīng)用于臨床治療。但本研究尚處于初步探索階段，F(xiàn)YD調(diào)控的具體機制及關(guān)鍵的靶位點尚不清楚，尚需進一步深入研究。