香榧僵果調查與解剖學觀察

王哲， 吳詩涵， 索金偉， 吳家勝

(浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300)

香榧是紅豆杉科榧樹屬雌雄異株的常綠喬木，是經過無性繁殖選育出的產量高、風味好的優良栽培品種[1]。香榧屬于裸子植物門，沒有真正的果實，但由于其種實在形態上呈核果狀，一般將其劃為堅果，稱為種實。相對于其他的榧樹類型，香榧種實的種仁(包含胚和胚乳)含有豐富的油脂、蛋白質、維生素等營養物質，香脆可口，具有很高的保健、藥用和綜合開發利用價值[2-3]。香榧種實具有綠色肉質假種皮，上有縱棱紋，外有白粉；種實呈長圓形或橄欖形，基部有宿存的苞鱗和珠鱗，頂部有凸起的短尖頭。假種皮內是骨質種皮、紅色膜質內種皮(俗稱種衣)，胚乳具有褶皺，呈乳白色至乳黃色[4]。

香榧種實發育成熟經歷時間長，從授粉到種實成熟需要跨年歷時17個月，當年4月開花授粉后至翌年9月采收前，樹上可同時看到大小2種種實(小的是當年授粉的種實，大的是去年授粉的種實)，即所謂“二代果”現象[5]。香榧種實生長發育大致可分為以下幾個時期：當年4月中旬左右進行開花授粉，授粉后幼果包裹于苞鱗和珠鱗中，并于當年9—10月完成受精，原胚形成[6-7]。此后，幼果一直包裹于苞鱗和珠鱗中越冬，體積沒有明顯增長，外觀和質量上幾無變化。直到翌年4月初，種實開始啟動細胞分裂和膨大，逐漸從種鱗中突破出來；5月初幼果開始進入旺盛的生長期，含水率開始上升，種實體積明顯增大，種實內干物質的積累也加快。在快速生長初期，種仁(包含胚和胚乳)呈液體狀，到6月中旬種仁呈凝膠狀并逐漸硬化；7月初至9月初是種實內部充實階段，此時種實的體積不再有明顯變化，淀粉逐漸降解，油脂含量不斷升高。9月初至秋分之間種實成熟，假種皮由綠色轉為黃綠色或淡黃色，有的假種皮開裂，少量種實落地，此時便是采收時期[8]。人們長期觀察發現，香榧種實在發育初期會有大量種實無法突破種鱗而停止生長，但仍宿存在結果枝上，這類種實稱為“僵果”。據調查，部分香榧林分僵果率高達95%，嚴重制約香榧產量，是當前香榧產業發展的關鍵瓶頸因素，因此，對香榧僵果的研究十分重要。對于香榧僵果的調查和研究還未見報道，完善的觀察是研究香榧僵果發生原因、提高香榧產量的重要前提。對香榧僵果的調查和解剖學觀察可以為香榧種實發育研究提供參考，對促進香榧產業持續發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

于浙江省杭州市臨安區浙江農林大學香榧種植基地隨機選取5株長勢良好的香榧作為觀測對象。試驗地為土質疏松、排水良好的山坡地，基地采用統一的田間施肥管理，3月中旬施入速效肥，9月中旬采果以后施用化肥和有機肥。

1.2 方法

1.2.1 香榧種實發育及僵果率調查

從2018年4月一年生枝上的營養芽抽梢、混合芽開花開始到9月采收結束，每3～5 d觀察香榧種實生長發育變化，記錄僵果發生情況。

1.2.2 敗育香榧的組織切片觀察

采集授粉后一年生和二年生枝條上的香榧僵果各6對，按照常規石蠟制片法制片，觀察胚珠結構。具體方法如下。

固定。將香榧種實浸沒于FAA固定液中固定24 h。

脫水。固定好的香榧材料取出后用70%乙醇稍加沖洗，再依次用50%、70%、85%、95%、100%濃度梯度的乙醇浸沒，100%乙醇重復2次，以完全置換掉組織內的水分，每級1 h。

透明。將脫水的材料依次用不同比例的乙醇、二甲苯溶液(2∶3、1∶1、1∶2)浸沒，再用純二甲苯浸沒2次，每級1.5 h，使組織中乙醇完全被二甲苯替代從而透明。

浸蠟。將材料取出，轉入到帶刻度的50 mL離心管，從不同比例的二甲苯和石蠟的溶液逐步過渡到純蠟，使材料中的二甲苯完全被石蠟置換。

包埋。將熔化的純蠟倒入小紙盒中，將小紙盒置于冰水上，再將材料放入小紙盒，使用加熱過的鑷子調整材料位置，待小紙盒中的石蠟表面凝固后壓入水中冷卻。

修蠟。將蠟塊中材料周邊的蠟修整為長方體，材料隱約可見。

切片。將材料置于Leica RM2235全自動切片機蠟座上，切出蠟帶，切片厚度7～8 μm。

黏片。在干凈的載玻片上加入1%明膠1滴并涂勻，加入數滴展片劑(2%～4%甲醛溶液)，將材料截斷后平置于載玻片上，將載玻片置于42 ℃烤片機上烘烤，2 min后用吸水紙吸干水分，再烘烤2 min，裝入切片盒中。染色前烘箱37 ℃繼續烘烤1～2 d。

脫蠟。按100%二甲苯1→100%二甲苯2→1/2二甲苯+1/2乙醇→100%乙醇1→100%乙醇2→95%乙醇→85%乙醇→75%乙醇→50%乙醇→35%乙醇→蒸餾水的順序依次浸沒，每級5 min。

染色。采用番紅與固綠色法。番紅用1%的水溶液，固綠用0.5%的乙醇液，番紅染色時間2～4 h，固綠染色時間為20 s。

1.2.3 香榧僵果發生的位置效應

隨機選取247根香榧一年生枝條，將枝條分為上、中、下3段，從最靠近主枝的對果位置開始，依次編為1～11號，統計不同位置形成不同類型對果的頻率，計數不同類型對果數目。隨機選取香榧二年生枝條，按其在樹體上所處位置的高度分為上、下二類枝條，按樹體朝向分為東、南、西、北四類枝條，按僵果數與幼果總數之比統計僵果率。

2 結果與分析

2.1 香榧種實敗育的觀察

在香榧種實發育過程中，僵果始于授粉后翌年的4月下旬，在部分種實迅速膨大的同時，部分種實停止生長，在體積上有明顯差異。僵果主要發生在種鱗裂開時期和胚珠突破初期，有些僵果的種鱗不會裂開，有些僵果的種鱗裂開，但胚珠的高度不會超過種鱗。香榧僵果按照對果的數目可分為雙膨果、單僵果和雙僵果3類，僵果數目依次為0、1、2，具體見圖1。

圖1 一年生枝條和二年生枝條上的雙僵果、單僵果和雙膨果

2.2 香榧雌花和種實發育階段敗育的組織觀察

如圖2所示，香榧僵果自4月初開始，其幼果珠心組織萎縮，同時僵果細胞顯示出更多的紅色，表明木質化程度更高。5月初正常發育種實的胚乳發育良好，體積增大，胚乳細胞豐富飽滿；而僵果無胚乳分化，萎蔫，內部組織降解。

圖2 一年生枝條和二年生枝條上僵果結構

2.3 香榧種實敗育的位置效應

不同類型對果在枝條上的分布如表1所示。在247根一年生枝條上，共有雙膨果158對，單僵果753對，雙僵果690對，比例分別是10%、47%、43%。在1號位置上，雙膨果、單僵果和雙僵果的數目依次為44、118、85，頻率依次為0.178、0.478、0.433。從每對果的位置來看，2號位置的雙膨果數目最少，雙僵果數目最多；從對果在枝條上的位置來看，枝條下端的雙僵果數目最多。

表1 一年生枝條上香榧不同類型對果的分布情況

不同方位和不同單株二年生枝條上僵果率情況如表2所示，統計幼果總數5 571個，各方向至少統計1 200顆，平均僵果率為89%，朝南的僵果率最低，下方僵果率比上方低。

表2 不同方位二年生枝條上香榧僵果率

3 小結與討論

種實敗育是植物普遍存在的一種現象，導致敗育的因素包括授粉受精不良，營養缺乏，環境脅迫等[9]。授粉期的珠心敗育是授粉不良導致的，目前通過人工授粉已經可以顯著提高香榧授粉期的掛果數量[10]。香榧種實敗育(僵果)主要發生在幼果開始膨大時，此時僵果率很高。本次觀察到的僵果率達89%，對香榧產量有很大影響，同時也表明香榧還有很大的增產空間。已有田間試驗發現，通過在香榧花期和幼果期噴施提高細胞活性的植物生長調節劑能有效提高香榧產量[11]，但是幼果期具體的調節機制還有待進一步研究。

通過對香榧僵果發生的位置調查發現，位于枝條下端(基端)的對果容易發生雙僵果，上端的對果主要發生單個僵果；朝南方的僵果率最低，樹體下方僵果率比上方低，但總體上差異不顯著，位置效應不明顯。有研究發現，光照是氣候因子中影響香榧產量的主要因素[12]，同時光合同化物對于植物種實的正常發育至關重要[13]。因此，枝條下端(基端)對果雙僵果更多發生可能是由于遮擋導致的光照相對不足，朝南方向枝條上僵果率較低可能是朝南方向光照更充足所致。