紹興鴨小群保種效果的分子生物學監測

劉莉君， 章曉煒， 馬敏彪， 陸建定， 王珍珍， 盧立志， 劉雅麗*

(1.浙江省畜牧技術推廣總站，浙江 杭州 310021； 2.浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310021)

紹興鴨屬蛋用型品種，中心產區為紹興、上虞、諸暨、肖山、余姚等市(縣)，陸游的《稽山行》一詩中有“坡放萬頭鴨，園復千畦姜”之句，可見紹興養鴨歷史悠久。紹興鴨具有體型小、產蛋多、耗料少、成熟早和適應性強等特點，是我國優良的蛋用型鴨種[1]。現階段，多用微衛星手段輔助監測動物群體遺傳結構穩定性及遺傳物質多樣性，從而對保種群體的穩定性做出判斷。微衛星是由循環序列和兩翼的保守序列構成，核心序列的循環次數不同形成了微衛星的高度多態性，具有分布廣、特異性強、易檢測等特點[2-4]。本研究利用微衛星標記分析采用各家系小群保種紹興鴨的遺傳多樣性，旨在評價該方式的保種效果，以期找到最適的保種方式，為紹興鴨資源的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血樣來源

隨機采集紹興咸亨紹鴨育種有限公司原種場的兩個世代30個家系的紹興鴨血液，每個世代60只個體，群體比例為1∶1，公鴨30只，母鴨30只，兩個世代共計120只。

1.1.2 主要試劑及儀器

TaKaRa Blood Genome DNA Extraction Kit試劑盒購置于寶生物工程(大連)有限公司。

一次性人體靜脈血樣采集容器(含EDTA-K2)(江蘇康捷醫療器械有限公司)；ABI3730XL全自動DNA測序儀(ABI3730XL，美國應用生物系統公司)。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集

通過每只鴨的翅靜脈采集0.5 mL血液，置于2 mL真空采血管，-20 ℃保存。

1.2.2 DNA提取

根據TaKaRa Blood Genome DNA Extraction Kit試劑盒的說明，提取DNA。

1.2.3 微衛星引物篩選

根據GenBank和文獻[5-7]提供的鴨的微衛星序列設計引物，引物由上海捷瑞生物技術有限公司合成，并對合成的引物進行篩選，最終選擇28對微衛星引物(表1)。

1.2.4 PCR擴增反應程序及反應體系

反應程序：94 ℃預變性處理5 min；隨后按照94 ℃變性反應30 s、52～64 ℃退火35 s、72 ℃延伸40 s 3步進行35個擴增循環；最后在72 ℃繼續延伸10 min。

反應體系：DNA 2 μL，l0×Taq Buffer 2 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，0.2 mmol·L-1dNTP 0.2 μL，上下游引物(5 pmol·L-1)各1 μL，ddH2O補齊至20 μL。

1.2.5 PCR產物檢測

利用ABI 3730XL測序儀通過毛細管電泳，檢測PCR產物片段大小?？倻y序含量為10 μL，包括高質量去離子甲酞胺Hi-Di Formamide 7.5 μL，引物(表1)的PCR擴增產物2 μL和GS-500 SizeStandard(標準內參)0.5 μL。

1.3 統計分析

采用GeneMaker 2.6.0軟件讀出各座位各目標片段大小，判斷純合子或雜合子(單峰和雙峰)；采用Microsatellite-Toolkit軟件對群體遺傳多樣性參數進行統計分析；采用Popgene 32軟件對所檢測座位的哈代-溫伯格平衡、Nei氏遺傳距離及相似性進行統計分析；兩個世代的所有數據通過SPSS 17.0軟件分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 微衛星座位檢測分型

經ABI3730XL DNA Analyzer全自動測序儀對28個座位進行檢測掃描，由GeneMaker 2.6.0自動生成圖譜，圖1為其中一個座位的基因型。

圖1 某座位的基因分型

2.2 等位基因比較

經過一個世代的保種，等位基因數基本保持不變(表2)，兩個世代各微衛星基因座位的平均等位基因(P=0.965)和優勢等位基因頻率(P=0.538)差異均不顯著。

表2 兩個世代群體等位基因數、優勢基因片段大小及頻率

2.3 基因座位遺傳多態性比較

兩個世代群體各微衛星座位遺傳多態性見表3。兩個世代的多態信息含量值(PIC)為0.184 2～0.846 2，其中APH14和CMO12兩個座位為低度多態(PIC<0.25)，其他座位為中高度多態(PIC>0.25)；兩個世代群體PIC平均值分別為0.483 2和0.479 3，差異不顯著(P=0.703)；He值(期望雜合度)在0.208 4～0.868 2，平均值分別為0.502 8和0.513 8，兩個世代無顯著差異(P=0.482)；Ho值(表觀雜合度)在0.172 9～0.964 8，兩個世代平均值分別為0.650 0和0.639 3，差異不顯著(P=0.903)。

表3 兩個世代在28個基因座位遺傳多態性

2.4 遺傳變異檢測

通過對兩個世代每個座位的哈代-溫伯格的檢驗(表4)，結果發現，27世代有7個不平衡座位，28世代有8個不平衡座位。從表5可以看出，兩個世代間Nei氏相似性系數為0.991 5，Nei氏遺傳距離為0.008 5，Nei氏相似性系數極高且遺傳距離極低，符合保種群世代間遺傳規律。

表4 兩世代28個基因座位的哈代-溫伯格檢驗

表5 兩個世代的Nei氏遺傳距離及相似性系數

2.5 群體有效含量檢測

該保種場采用小群體隨機留種保種方法，保種群約550只(母鴨500只，公鴨50只)，按照公式Ne=4 Ns·Nd/Ns﹢Nd計算得出該保種場群體有效數量(Ne)為182只，每代近交增量(ΔF)為0.27%，近交系數達到5%需要19個世代。

3 小結與討論

有效等位基因、雜合度(H)、多態信息含量(PIC)均是反映品種內遺傳變異大小的量度[8]。遺傳多樣性的雜合度指標可以反映各群體在多個座位上的遺傳變異，Takezaki等[9]認為，用于測定遺傳差異的標記在群體中的平均雜合度在0.3～0.8才有實際意義。多態信息含量是檢測等位基因變異程度高低的主要指標之一，當PIC>0.5時，為高度多態性，當0.25

本研究利用28個微衛星座位分析了紹興鴨小群保種的兩個世代群體遺傳多樣性及保種效果，結果顯示，在分子水平指標均無顯著性變化。其中，兩世代的He平均值分別為0.502 8和0.513 8，Ho平均值分別為0.650 0和0.639 3，均在0.3～0.8，兩個世代的APH14和CMO12座位表現為低度多態，其余座位表現為中高度多態(PIC>0.25)。兩世代PIC平均值分別為0.483 2和0.479 3，處于中度多態。通過一個世代更替，等位基因數略有上升，兩世代平均等位基因和優勢等位基因頻率差異均不顯著。

哈代-溫伯格檢驗和群體有效數量也是反映群體遺傳穩定性的重要指標。本研究的兩個世代紹興鴨28個微衛星座位中分別有7和8個座位處于不平衡狀態，低于張靜等[11]的18個微衛星基座中有14個座位處于不平衡狀態，但依舊表明該保種群遺傳結構逐漸趨于不平衡狀態，主要原因可能是各家系小群保種采用輪配方式導致隨機性變小而引起的遺傳漂變，因此，保種場可以擴大各家系保種數量，同時增加群體保種的方式來提高群體遺傳穩定性。該保種場目前的有效保種群體數量(Ne)為182只，世代的ΔF為0.27%，符合世代增量低于0.50%的原則，表明小群保種能夠有效的保存紹興鴨的品種特征，對水禽采用這種保種方法是可行的，可以作為監管部門保種監測的輔助手段。