山東省羅莊區(qū)2種鐵線蓮的指紋圖譜研究

杜希揚(yáng)，趙治勇，彭善祥，高立虎，李 強(qiáng)，孫兆祥，公素琴

（山東省臨沂市中醫(yī)醫(yī)院，山東 臨沂 276002）

毛茛科鐵線蓮屬植物在我國(guó)種類繁多，分布極廣[1]。作為中藥威靈仙的來源，《中國(guó)藥典》僅收錄威靈仙ClematischinensisOsbeck、棉團(tuán)鐵線蓮ClematishexapetalaPall.或東北鐵線蓮Clematis manshuricaRupr，但全國(guó)范圍內(nèi)威靈仙用藥比較混亂[2]。第四次全國(guó)中藥資源普查中課題組發(fā)現(xiàn)，山東境內(nèi)鐵線蓮屬植物主要為長(zhǎng)冬草Clematishexapetalavar.tchefouensis和太行鐵線蓮Clematis kirilowiiMaxim.。孫兆祥[3]通過生藥學(xué)鑒定研究發(fā)現(xiàn)，太行鐵線蓮與威靈仙有著諸多共同特征，并預(yù)測(cè)其主要成分類似。徐凌川等[4]對(duì)山東省太行鐵線蓮薄層研究，發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分與威靈仙相似，具有潛在的藥用價(jià)值。研究[5-7]通過對(duì)貴州地區(qū)威靈仙主要來源柱果鐵線蓮ClematisuncinataChamp.的HPLC指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)其與藥典收錄品種威靈仙親緣較近。為了進(jìn)一步研究長(zhǎng)冬草、太行鐵線蓮與藥用威靈仙的內(nèi)在關(guān)系，開發(fā)山東中藥資源，本課題組對(duì)其展開HPLC液相指紋圖譜的研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國(guó)賽默飛高效液相色譜儀：UltiMate3000系列，WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），AUW120D精密電子天平（SHIMADZU公司）。

1.2 試藥

威靈仙對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121189-201102），威靈仙（棉團(tuán)鐵線蓮）對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121578-201202），長(zhǎng)冬草（采挖自羅莊區(qū)黑石山），太行鐵線蓮（采挖自羅莊區(qū)黑石山），磷酸、乙腈為色譜純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動(dòng)相：采用乙腈（A）-0.2%磷酸水（B）進(jìn)行線性梯度洗脫，0～25 min（A：0.1%～4%）；25～ 30 min（A：4% ～ 13%）；30～ 60 min（A：13% ～ 25%）；60～ 80 min（A：25%～40%）；80～100 min（A：40%～60%）；100～ 120 min （A：60% ～ 80%）；120～ 140 min（A：80% ～ 100%）；140～ 160 min（A：100%～100%），體積流量：0.8 ml·min-1；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；運(yùn)行時(shí)間：160 min。

2.2 供試品溶液制備

對(duì)照藥材及采挖藥材，分別粉碎，各取粉末（過5號(hào)篩）1.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇適量，超聲提取30 min，放冷，用甲醇定容至50 mL，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 空白試驗(yàn) 精密吸取提取液（甲醇）10 μL，注入高效液相色譜儀，按規(guī)定梯度條件進(jìn)行洗脫。結(jié)果表明空白不干擾測(cè)定。

2.3.2 分析時(shí)間確定試驗(yàn) 取威靈仙對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121189-201102）供試品溶液按要求進(jìn)樣，在洗脫 160 min 后，再保持100%乙腈洗脫20 min。經(jīng)分析，長(zhǎng)冬草經(jīng)梯度洗脫，在保留時(shí)間160 min后已無成分殘留。確定長(zhǎng)冬草指紋圖譜的分析時(shí)間為160 min。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取威靈仙對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121189-201102）溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積相對(duì)比值的RSD值分別為0.06%～0.88%和0.24%～1.90%，表明該方法精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品太行鐵線蓮（羅莊黑石山）溶液6份，測(cè)得各峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積相對(duì)比值的RSD值分別為0.16%～0.96%和0.43%～1.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品威靈仙對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)121189-201102）溶液，分別在 0、6、12、18、24 h檢測(cè)，測(cè)得各峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積相對(duì)比值的RSD值分別為0.07%～0.94%和0.18%～1.70%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 建立指紋圖譜

分別精密吸取各供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.1 項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)不同供試品測(cè)定結(jié)果所給出的峰值、峰數(shù)和相對(duì)保留時(shí)間等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析，優(yōu)化制定指紋圖譜，見圖1，圖 2。

圖1 威靈仙指紋圖譜

圖2 4種鐵線蓮指紋圖譜

2.5 指紋圖譜分析

2.5.1 4種鐵線蓮相似度評(píng)價(jià) 將收集羅莊黑石山的2種鐵線蓮：長(zhǎng)冬草和太行鐵線蓮各一批與威靈仙標(biāo)準(zhǔn)藥材和威靈仙（棉團(tuán)鐵線蓮）各一批的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2012版相似度軟件，以威靈仙為參照，建立對(duì)照?qǐng)D譜，并進(jìn)行相似度的評(píng)價(jià)，見表 1。

表1 4種鐵線蓮指紋圖譜相似度

2.5.2 4種鐵線蓮峰分析 以威靈仙指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，經(jīng)過《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2012版分析后共計(jì)45個(gè)峰，見表2。其中4種鐵線蓮共有峰11個(gè)，威靈仙、威靈仙（棉團(tuán)鐵線蓮）、太行鐵線蓮、長(zhǎng)冬草共有峰面積各占其總峰面積的74.1%、78.4%、73.5%和61.0%。太行鐵線蓮與威靈仙的共有峰面積分別占其總峰面積的87.0%和83.0%，與威靈仙（棉團(tuán)鐵線蓮）的共有峰面積分別占其總面積的76.7%和87.4%；長(zhǎng)冬草與威靈仙的共有峰面積分別占其總峰面積的89.9%和89.1%，與威靈仙（棉團(tuán)鐵線蓮）的共有峰面積分別占其總面積的62.9%和88.1%；長(zhǎng)冬草與太行鐵線蓮共有峰面積分別占其總峰面積的91.4%和90.8%。

表2 4種鐵線蓮峰面積及保留時(shí)間

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)于藥材提取試驗(yàn)了50%乙醇、70%乙醇、乙醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇等不同的溶劑、不同的時(shí)間以及不同的提取方式，發(fā)現(xiàn)甲醇超聲60 min藥材成分提取較完全，但超聲提取30 min差距不大且無穩(wěn)定性差異，因此采用甲醇超聲提取30 min作為藥材提取方法。

色譜條件的確定過程中，以威靈仙對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121189-201102）為主，并兼顧了其他3個(gè)品種的色譜峰分離情況。試驗(yàn)中考察了甲醇-水、甲醇-0.1%水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.2% 磷酸水等不同體積分?jǐn)?shù)、不同比例的流動(dòng)相，結(jié)果顯示以乙腈-0.2%磷酸水為流動(dòng)相相比其他流動(dòng)相分離度高，峰形好，基線穩(wěn)定；通過采用DAD（二極管陣列）檢測(cè)器對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在210 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，威靈仙色譜中基線較平穩(wěn)，信息豐富，故以此為檢測(cè)波長(zhǎng)。

我國(guó)目前鐵線蓮屬植物約有108種，其所含化學(xué)成分多種多樣，但其中主要成分為三萜類化合物[8]。通過此次試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)威靈仙與威靈仙（棉團(tuán)鐵線蓮）指紋圖譜相似度較高，證實(shí)藥典收錄的兩種藥材成分相似度較高。4個(gè)品種共有11個(gè)共有峰，共有峰面積各占其總峰面積比例較高，證明其主要成分相似性較高。同時(shí)經(jīng)過對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)太行鐵線蓮與長(zhǎng)冬草共有峰面積占各自總峰面積高達(dá)90.8%和91.4%，提示生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)植物主要成分影響巨大，對(duì)于道地藥材可以提供側(cè)面支持。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)對(duì)比，不論太行鐵線蓮還是長(zhǎng)冬草,其與藥典收錄的2種威靈仙藥材主要成分相似，但其相似成分是否為威靈仙功效的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不得而知[9]。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，從鐵線蓮中分離出不同的化合物，經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，各化學(xué)成分分別具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[10]。威靈仙起源于北方，其自古是否存在混用尚不得而知[11]。第四次中藥資源普查羅莊隊(duì)發(fā)現(xiàn)其同屬長(zhǎng)冬草、太行鐵線蓮蘊(yùn)藏量巨大。本課題組對(duì)其是否存在藥用價(jià)值展開了文獻(xiàn)查閱，現(xiàn)進(jìn)行了指紋圖譜的對(duì)比，下一步將建立以各有效成分組成的指紋圖譜，將其與4種鐵線蓮對(duì)比，以期確定山東2種鐵線蓮是否具有藥典收錄的威靈仙的藥用功能，以期為中藥資源的應(yīng)用開發(fā)提出一定的思路。