羥異梔子苷對抑郁大鼠HPA軸的影響及機制研究

雷秀雯 李艷紅 黃松翠 李淑宇

洛陽市第五人民醫院 河南，洛陽 471000

抑郁癥是臨床常見的精神系統疾病，以情緒持續低落、興趣喪失及行為異常為主要表現。近年來隨著人們生活壓力的增加，抑郁癥發病率呈升高趨勢，已成為非衰老致殘或致死的主要疾病之一，對社會及患者家庭造成嚴重影響[1]。目前，臨床常采用氟西汀、奧氮平等非典型抗精神病藥物治療抑郁癥，但長期服用后，睡眠障礙、便秘等副作用較為明顯，且存在藥物依賴性強、易復發等缺點[2-3]。因此，亟需尋找安全有效的藥物治療抑郁癥。

中藥梔子具有廣泛的藥理學活性，是經典抗抑郁中藥方劑梔子厚樸湯及越鞠丸的主要藥物[4]。羥異梔子苷（hydroxyisogeniposide，HGP）是從梔子干燥果實或根莖中提取的活性成分，是梔子發揮藥效的活性成分之一，具有抗氧化、神經保護等多種藥理學作用[5]，但目前關于其對抑郁癥的影響及機制研究較少。鑒于此，本研究通過復制抑郁癥大鼠模型，觀察不同劑量HGP對抑郁癥大鼠抑郁行為及下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA）軸的影響，探討其調控機制，以期為抑郁癥的臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級SD大鼠60只，6周齡，體質量180～220g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物生產許可證號碼：SCXK（京）2016-0011]，飼養于洛陽普萊柯生物工程股份有限公司[實驗動物使用許可證號碼：SCXK（豫）2018-0011]，環境溫度24～26℃、濕度40%～60%，明暗交替。動物自由飲水和進食，實驗操作符合減少、替代和優化原則。

1.1.2 主要試劑和儀器 HGP（純度：98%；美國化學文摘服務社號：24512-62-7）購于西寶生物科技（上海）股份有限公司（批號：20200301）；鹽酸氟西汀膠囊購于法國Patheon France公司（國藥準字：J20170022；批號：20191211）；大鼠促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、皮質酮 （corticosterone，CORT）酶聯免疫吸附檢測（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒均購于美國R&D公司（批號：BYS12106B、hz-EL-R0269c）；實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real-time fluorescence quantification polymerase chain reaction，Real-time qPCR）試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司（批號：T2210）；兔抗大鼠糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）、下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）多抗（一抗）及山羊抗兔GR、CRH單抗（二抗）均購于美國Abcam公司（批號：ab83461、ab77686、ab144525、ab236982）；電化學發光試劑盒購于上海羅氏制藥有限公司（批號：B3817）。

ERM3100型石蠟切片機購于上海京工實業有限公司；Multiskan Sky型全波長酶標儀為美國Thermo Fisher公司產品，CheniDoc XRS型凝膠成像系統購于美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠抑郁模型建立 各組大鼠適應性飼養1周后，采用慢性不可預見性溫和應激法復制抑郁癥模型[6]：以7種應激源干預，包括擁擠鼠籠過夜、夾尾1min、束縛3h、4℃冰水游泳、45℃環境5min、160次·min-1水平振蕩30min和24h禁食禁水，每天1種，連續3周。以大鼠出現自主活動減少，對糖水興趣喪失、食欲不振等表現為建模成功。

1.2.2 分組及干預 將60只SD大鼠隨機分為對照組、抑郁組、HGP低、高劑量組和陽性藥組，各12只。除對照組外，其余各組采用慢性不可預見性溫和應激法復制抑郁癥大鼠模型，本研究所有大鼠均造模成功。參考文獻[7]，進行人與實驗動物用藥劑量換算，大鼠的臨床等效劑量為10mg·kg-1。對造模成功大鼠進行干預：HGP低、高劑量組分別予HGP臨床等效劑量（10mg·kg-1）和4倍臨床等效劑量（40mg·kg-1）灌胃，陽性藥物組予10mg·kg-1的鹽酸氟西汀灌胃，對照組和抑郁組予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，各組均1次/d，持續給藥2周。

1.2.3 糖水偏好實驗 實驗開展前適應性喂養糖水，末次給藥結束后，禁水12h，開始糖水偏好實驗。大鼠單籠飼養，同時放置含有2%蔗糖水和蒸餾水的瓶子，自由飲水12h，測定12h內蔗糖水和蒸餾水消耗量，計算糖水消耗占比（%）=蔗糖水消耗量/（蔗糖水消耗量+蒸餾水消耗量）×100%。

1.2.4 曠場實驗 糖水實驗結束后開始曠場實驗，將大鼠置于實驗環境適應30min后，放于96cm×96cm×50cm黑色敞箱（等分為16個方格）的正中央，觀察大鼠5min內的運動軌跡，記錄大鼠中央格停留時間（除邊緣格之外的格均劃為中央格）、運動總格數（某一肢體越過格子數）、修飾（理毛）次數。每只大鼠實驗結束后，以乙醇擦拭箱底，清除殘留氣味。

1.2.5 血漿ACTH、CORT水平檢測 糖水偏愛及曠場實驗結束后，采用0.3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹主動脈取血5mL，置于抗凝管中，3 000r·min-1離心10min，離心半徑12cm，取上層血漿，采用ELISA試劑盒檢測ACTH、CORT水平，嚴格按照試劑盒說明書步驟執行，酶標儀檢測450nm波長處吸光度值，根據標準曲線計算ACTH、CORT水平。

1.2.6 海馬組織病理學觀察 各組大鼠采血結束后處死，立即取腦組織，分離左右海馬組織與下丘腦，左側海馬組織以4%多聚甲醛固定48h備用，右側海馬和下丘腦組織-80℃保存備用。取4%多聚甲醛固定的腦組織，常規石蠟包埋，4μm連續切片，二甲苯透明、梯度乙醇脫水后，以蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，中性樹膠固定，光鏡下觀察海馬組織病理學改變情況。

1.2.7 海馬區GR及下丘腦CRH mRNA表達檢測取-80℃保存的海馬和下丘腦組織，Trizol法提取總RNA，反轉錄為互補鏈脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）并以之為模板進行Real-time qPCR，嚴格按照試劑盒說明書操作。以β-肌動蛋白（β-actin）為內參基因，采用2-△△CT計算目的基因的相對表達量。引物的設計與合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.8 海馬區GR及下丘腦CRH，蛋白表達檢測 取-80℃保存的海馬和下丘腦組織，液氮研磨后冰上裂解20min，12 000r·min-1離心20min，取上清液，沸水水浴10min，再次離心取上清液，以二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定總蛋白含量，然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳，經轉膜、封閉，加入1∶1 000稀釋的一抗，4℃搖床孵育過夜，加入1∶4 000稀釋的二抗，常溫孵育1.5h，加入電化學發光液，化學發光法曝光、顯影，凝膠成像系統掃描拍照，以目的蛋白與β-actin灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，多樣本資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）-t檢驗。 以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較 對照組大鼠一般情況無異常，其余各組造模期間毛發無光澤，行為從易激惹逐漸轉為反應遲鈍，喜臥少動，攝食量減少；HGP低、高劑量組和陽性藥組干預期間上述表現有所改善，其中HGP高劑量組和陽性藥組改善最為明顯。

2.2 各組大鼠糖水偏好實驗結果比較 各組間總體比較，糖水消耗占比差異有統計學意義（P＜0.001）。與對照組比較，其余4組糖水消耗占比均降低（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組糖水消耗占比均升高（P＜0.05），其中陽性藥組高于HGP高劑量組（P＜0.05），HGP高劑量組高于HGP低劑量組（P＜0.05）。 見表2。

表2 各組大鼠糖水消耗占比比較（±s）Tab.2 Comparison of the proportion of syrup consumption in each group（±s）

表2 各組大鼠糖水消耗占比比較（±s）Tab.2 Comparison of the proportion of syrup consumption in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與抑郁組比較，#P＜0.05；與HGP低劑量組比較，△P＜0.05；與HGP高劑量組比較，▲P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with depression group，#P＜0.05;compared with HGP low-dose group，△P＜0.05;compared with HGP high-dose group，▲P＜0.05

組別糖水消耗占比（%）對照組 87.61±6.10抑郁組 58.02±5.26*HGP 低劑量組 66.04±5.41*#HGP 高劑量組 71.38±5.91*#△陽性藥組 80.25±6.70*#△▲F值 37.568 P值 ＜0.001

2.3 各組大鼠曠場實驗結果比較 各組間總體比較，曠場實驗運動格數、修飾次數及中央格停留時間差異均有統計學意義（P＜0.001）。與對照組比較，其余4組運動格數、修飾次數均減少，中央格停留時間延長（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組運動格數、修飾次數均增多，其中陽性藥組多于HGP高劑量組，HGP高劑量組多于HGP低劑量組（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組中央格停留時間縮短，其中陽性藥組短于HGP高劑量組，HGP高劑量組短于HGP低劑量組（P＜0.05）。 見表3。

表3 各組大鼠曠場實驗行為比較（±s）Tab.3 Comparison of experimental behavior of open field experiment in each group（±s）

表3 各組大鼠曠場實驗行為比較（±s）Tab.3 Comparison of experimental behavior of open field experiment in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與抑郁組比較，#P＜0.05；與HGP低劑量組比較，△P＜0.05；與HGP高劑量組比較，▲P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with depression group，#P＜0.05;compared with HGP low-dose group，△P＜0.05;compared with HGP high-dose group，▲P＜0.05

組別 運動格數（格） 修飾次數（次） 中央格停留時間（s）對照組 59.10±7.03 6.22±0.95 1.95±0.70抑郁組 27.39±7.15* 3.16±0.87* 8.50±1.10*HGP 低劑量組 35.81±7.50*# 4.02±0.60*# 7.48±1.05*#HGP 高劑量組 48.62±8.34*#△ 4.65±0.58*#△ 5.36±1.12*#△陽性藥組 53.01±8.01*#△▲ 5.43±0.69*#△▲ 4.27±0.98*#△▲F值 28.078 25.070 70.790 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 各組大鼠血漿ACTH、CORT水平比較 各組間總體比較，血漿ACTH、CORT水平差異均有統計學意義（P＜0.001）。與對照組比較，其余4組血漿ACTH、CORT水平均升高（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組血漿ACTH、CORT水平均降低，其中HGP高劑量組和陽性藥組均低于HGP低劑量組（P＜0.05）；與陽性藥組比較，HGP高劑量組差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表4。

表4 各組大鼠血漿ACTH、CORT水平比較（±s，ng·L-1）Tab.4 Comparison of plasma ACTH and CORT levels in each group（±s，ng·L-1）

表4 各組大鼠血漿ACTH、CORT水平比較（±s，ng·L-1）Tab.4 Comparison of plasma ACTH and CORT levels in each group（±s，ng·L-1）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與抑郁組比較，#P＜0.05；與HGP低劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with depression group，#P＜0.05;compared with HGP low-dose group，△P＜0.05

組別ACTH CORT對照組 41.60±6.37 162.54±16.32抑郁組 67.11±6.22* 285.30±18.24*HGP 低劑量組 61.39±6.08*# 254.94±17.03*#HGP 高劑量組 50.26±6.16*#△ 225.48±14.50*#△陽性藥組 48.12±5.85*#△ 216.07±15.74*#△F值 28.936 221.866 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.5 各組大鼠海馬CA3區病理組織學改變比較 對照組大鼠海馬CA3區神經元結構正常，細胞形態規則，排列整齊；抑郁組神經元排列雜亂疏松，細胞質深染，細胞核固縮，部分空泡化，可見變性壞死細胞；HGP低、高劑量組和陽性藥組CA3區病變較抑郁組減輕，其中HGP高劑量組和陽性藥組減輕最為明顯，可見神經元排列整齊，細胞膜和細胞核結構較為完整。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬CA3區病理組織學觀察（HE染色，200×）Fig.1 Histopathological observation of hippocampal CA3 area in each group（HE staining，200×）

2.6 各組大鼠海馬區GR及下丘腦CRH mRNA表達比較 各組間總體比較，海馬區GR及下丘腦CRH mRNA相對表達量差異有統計學意義（P＜0.001）。與對照組比較，其余4組海馬區GR mRNA相對表達量均降低，下丘腦CRH mRNA相對表達量均升高（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組海馬區GR mRNA相對表達量均升高，其中陽性藥組高于HGP高劑量組，HGP高劑量組高于HGP低劑量組（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組下丘腦CRH mRNA相對表達量降低，其中陽性藥組低于HGP高劑量組，HGP高劑量組低于HGP低劑量組（P＜0.05）。 見表5。

表5 各組大鼠海馬區GR及下丘腦CRH mRNA表達比較（±s）Tab.5 Comparison of mRNA expression of GR in hippocampus and CRH in hypothalamus（±s）

表5 各組大鼠海馬區GR及下丘腦CRH mRNA表達比較（±s）Tab.5 Comparison of mRNA expression of GR in hippocampus and CRH in hypothalamus（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與抑郁組比較，#P＜0.05；與HGP低劑量組比較，△P＜0.05；與HGP高劑量組比較，▲P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with depression group，#P＜0.05;compared with HGP low-dose group，△P＜0.05;compared with HGP high-dose group，▲P＜0.05

組別GR CRH對照組 1.05±0.12 0.95±0.10抑郁組 0.16±0.03* 3.71±0.20*HGP 低劑量組 0.42±0.05*# 3.06±0.16*#HGP 高劑量組 0.78±0.06*#△ 2.13±0.15*#△陽性藥組 0.90±0.06*#△▲ 1.84±0.12*#△▲F值 56.417 124.587 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.7 各組大鼠海馬區GR及下丘腦CRH蛋白表達比較 各組間總體比較，海馬區GR及下丘腦CRH蛋白相對表達量差異均有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，其余4組海馬區GR蛋白相對表達量均降低，下丘腦CRH蛋白相對表達量均升高（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組海馬區GR蛋白相對表達量均升高，其中陽性藥組高于HGP高劑量組，HGP高劑量組高于HGP低劑量組（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組下丘腦CRH蛋白相對表達量降低，其中陽性藥組低于HGP高劑量組，HGP高劑量組低于HGP低劑量組（P＜0.05）。 見圖2。

圖2 各組大鼠海馬區GR及下丘腦CRH蛋白表達比較Fig.2 Comparison of protein expression of GR in hippocampus and CRH in hypothalamus in each group

3 討論

抑郁癥屬于世界范圍的流行性精神疾病，全球發病率達4.7%，給社會造成了極大的醫療負擔[8]。臨床調查表明，抑郁癥的發病與生理因素、環境因素及遺傳因素等多種因素相互作用有關，但具體發病機制尚未明確[9-10]。近年來研究發現，神經-內分泌系統參與了抑郁癥的發生及發展，其中HPA軸功能失調是抑郁癥發生的主要機制之一[11]。目前，藥物治療仍是抑郁癥主要治療手段。據報道，長期服用西藥抗抑郁藥治療的患者中，約35%患者出現了藥物抵抗，治療效果不佳；此外，藥物副作用也影響了患者服藥依從性，進一步增加了治療難度[12]。

中醫藥從整體辨證治療精神系統疾病，具有療效確切、副作用少等多種優勢[13-14]。梔子無毒，入肺、心、肝經，是抗抑郁中藥方劑中的常用藥材。HGP是從梔子中提取的環醚萜類化合物，同時也是梔子發揮藥效的主要成分之一[15-16]。研究表明，HGP可有效改善慢性不可預見性應激抑郁癥大鼠的抑郁和焦慮癥狀，證實其具有調整神經行為學的作用[17]。Ma等[18]應用梔子苷干預脂多糖誘導的類神經細胞株PC12炎癥損傷模型，結果顯示梔子苷能夠降低PC12細胞培養上清液中的促炎因子水平，抑制PC12細胞凋亡。Yu等[19]研究顯示，HGP聯合臭氧可抑制坐骨神經損傷大鼠的神經病理性疼痛，促進神經細胞修復。上述研究均說明梔子苷具有神經保護作用。本研究發現，抑郁組大鼠糖水消耗占比、運動格數、修飾次數較對照組減少，中央格停留時間延長，表現出空間探索能力不足、對自身關注程度降低等典型抑郁行為學特征[20]，HE染色顯示海馬CA3區出現病理損傷，出現神經元細胞壞死的表現，提示抑郁癥大鼠模型復制成功；而采用不同劑量HGP干預后，大鼠抑郁行為學表現得到改善，海馬CA3區病理損傷減輕，且高劑量改善更為明顯，但陽性藥組改善程度仍優于高劑量HGP，提示HGP可有效改善抑郁大鼠行為學表現，抑制海馬神經元損傷，但改善效果仍需進一步提高。

既往研究顯示，抑郁癥患者血清及腦脊液中HPA軸相關激素和受體表達呈異常升高趨勢，HPA軸表現為持續激活，伴有神經內分泌表現異常，ACTH和CORT過度分泌，導致海馬神經元損傷[21-22]。抑郁狀態下血漿ACTH、CORT水平異常升高，且與抑郁程度呈正相關，抗抑郁治療后隨之下降[23]。研究發現，海馬區是與情緒調節和學習記憶功能密切相關的腦區，HPA軸各激素的水平受海馬區負反饋調節，分布于海馬區的Ⅱ型GR是主要調控分子，其表達水平對于HPA軸負反饋調節至關重要[24]。Xu等[25]研究發現，青春期應激所致抑郁雄鼠存在海馬GR表達下調現象，且其表達水平與抑郁樣行為有關。本研究結果提示，抑郁組大鼠海馬區GR mRNA和蛋白表達下調，下丘腦CRH mRNA和蛋白表達上調，說明抑郁癥大鼠存在HPA軸CRH功能亢進，而海馬GR負調控能力下降。采用不同劑量HGP干預后，大鼠海馬區GR mRNA和蛋白表達上調，下丘腦CRH mRNA和蛋白表達下調，且HGP不同劑量間比較，高劑量HGP調控能力更強，提示HGP可能通過調控HPA軸改善抑郁大鼠行為學表現及抑制神經系統損傷。本研究結果還顯示，高劑量HGP對HPA軸的調控能力弱于陽性藥鹽酸氟西汀，一方面可能與用藥劑量不足有關，另一方面，筆者推測除了對HPA軸的調控，HGP可能存在其他作用機制，需要進一步研究證實。

綜上所述，HGP可有效改善抑郁大鼠行為學表現，其抗抑郁機制可能與調控HPA軸有關，本研究結果可為HGP用于抑郁癥的治療提供初步的理論依據。在進一步研究中，應繼續深入探討HGP治療抑郁癥的作用機制，為臨床應用提供更充足的理論支持。