NLRP3炎癥小體在痛風性關節炎中的作用及中藥干預研究進展

史悅悅 張曉熙 楚秉泉 夏道宗

浙江中醫藥大學藥學院 杭州 310053

痛風性關節炎（gouty arthritis，GA）是一種由嘌呤代謝紊亂所引起的代謝性疾病，其特征是尿酸來源增多或去路減少，造成體內尿酸代謝失衡，過多尿酸鹽以晶體形式沉積在關節囊、軟骨等部位，刺激炎癥產生[1]。GA的發病率逐年增長，且呈年輕化趨勢，嚴重影響了患者的生活質量及工作效率[2]。針對痛風，西醫多采用抗炎藥物或降尿酸藥物治療，具有較好療效，但停藥后易復發，且存在較多不良反應，如秋水仙堿易引起胃腸道反應、別嘌呤醇易引起皮疹等過敏反應[3]。中醫中藥治療痛風多以脾虛濕熱瘀阻為辨證要點，通過清除患者體內的濕、熱、瘀、毒之邪，并調和機體臟腑陰陽，達到協同治療的效果。相較于西藥，中藥治療從整體出發，通過辨證論治，對于復雜的病情判斷較為準確，臨床療效更為突出，在控制病情發展、降低不良反應等方面具有獨特的優勢，因此，中藥很可能成為未來抗痛風領域研究的熱點[4]。

Nod樣受體蛋白3（nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3）炎癥小體又稱Cryopyrin，最早在Muckle-Wells自身炎癥性疾病綜合征中被發現[5]。現已證明，NLRP3炎癥小體是許多疾病的重要治療分子靶點，在肺損傷[6]、心血管疾病[7]、帕金森綜合征[8]及GA[9]的治療研究中具有重要地位。NLRP3炎癥小體由NLRP3支架、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和效應蛋白半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1） 三部分組成。作為固有免疫的重要組成部分，NLRP3炎癥小體的激活和白細胞介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）的釋放在痛風進展中發揮了重要作用。本文基于NLRP3炎癥小體在GA中的作用，擬對中藥復方、單味中藥提取物、中藥單體化合物治療GA的研究進行系統梳理，以期為GA治療藥物的研發提供參考。

1 NLPR3炎癥小體與GA的關系

GA是一種自身炎癥性疾病，當血尿酸濃度過高時，尿酸以鈉鹽的形式沉積在關節中，引起組織異物炎性反應，因此先天免疫反應是GA組織破壞和炎癥反應的主要驅動力。2006年，Martinon等首次報道了尿酸鈉（monosodium urate，MSU）晶體能夠刺激NLRP3炎癥小體的激活，促進IL-1β的成熟活化[10]。同時有研究發現，GA患者關節滑膜中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA和蛋白表達增高[9，11-12]。 GA模型小鼠的關節勻漿中，NLRP3炎癥小體、核因子-κB/p65（nuclear factor-κB/p65，NF-κB/p65） 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的蛋白表達也明顯增加，NLRP3、ASC和caspase-1基因敲除小鼠則無法在MSU晶體誘導下產生炎癥反應[13]。以上都提示，NLRP3炎癥小體的激活與GA密切相關。基于NLRP3炎癥小體，現階段研究所涉及的中藥干預機制主要包括：影響活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，抑制NLPR3支架激活，抑制ASC斑點的形成，抑制NLRP3炎癥小體的組裝，負反饋調節炎癥因子產生以及抑制NF-κB對NLRP3炎癥小體的激活。MSU激活NLRP3炎癥小體，進一步誘發GA的病理機制見圖1。

圖1 MSU激活NLRP3炎癥小體誘發GA的病理機制

2 中藥干預NLRP3炎癥小體抗GA的研究進展

目前中醫將GA歸為“痹證”，其臨床用藥多以清熱化濕健脾及補虛為核心，兼顧活血化瘀、利濕除痹。中藥包括復方、單味藥提取物、單體活性成分，在GA治療中表現出了明顯的優勢。在檢索的80篇中英文文獻中，治療GA的中藥藥性多為寒性，藥味為甘，主歸脾、胃、腎經。基于NLRP3炎癥小體治療GA的相關中藥可分為以下幾大類：（1）清熱藥：土茯苓、知母、黃連、青蒿、冬凌草、綠茶、子菜；（2）利水滲濕藥：薏苡仁、茯苓、虎杖、菊苣；（3）化濕藥：蒼術、防己；（4）補虛藥：白術、黃芪、白芍；（5）活血化瘀藥：牛膝；（6）瀉下藥：大黃；（7）解表藥：桂枝、生姜、野菊花。了解中藥的性狀歸類，對未來靶向藥物及其他新藥的研究中具有重要意義。

2.1 中藥復方 臨床上治療GA的復方數量眾多，多在四妙散、當歸拈痛湯、萆薢滲濕湯、宣痹湯、桂枝芍藥知母湯、桂枝白虎湯、獨活寄生湯和五味消毒飲等基礎上加減而成[14]。獨活寄生湯是治療GA的傳統方劑，療效顯著，該方中幾種化合物甘草酸、茯苓酸、龍膽堿和芍藥苷起主要作用[15]。臨床研究發現，清熱除痹湯、痹寧湯能抑制炎性產物IL-1β的表達，可有效提升療效，降低全身炎癥反應，減輕疼痛[16-17]。加味黃芪桂枝五物湯由黃芪、桂枝、白芍、川芎、牛膝組成，動物實驗證實其能通過下調NLRP3表達，上調保護性細胞因子轉化生長因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）表達，有效改善關節的腫脹度，說明其作用機制與NLRP3炎癥小體相關[18]。知黃痛風湯能夠通過增加β-抑制蛋白2（β-arrestin 2，ARRB2） 表達，抑制NLRP3炎癥小體生成，從而抑制炎癥因子IL-1β、IL-18的產生，減輕GA的癥狀[19]。另有研究表明，桂枝芍藥知母湯抗GA的作用機制可能與降低中性粒細胞NLRP3、ASC表達，抑制NF-κB活化及IL-1β分化成熟有關；此外還能夠增加caspase-12表達，負反饋抑制NLRP3炎性小體信號通路激活，發揮抗痛風作用[20]。萆薜除痹湯能夠下調磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）通路，抑制NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β蛋白和基因的表達，從而防治GA[21]。 研究表明，MSU和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）同時刺激THP-1細胞可模擬出GA體外細胞模型，加味三妙丸能明顯下調該模型NLRP3、ASC、caspase-1、髓樣分化因子88（marrow like differentiation factor 88，MyD88）、Toll樣受體2（toll-like receptor 2，TLR2）、Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）等蛋白的表達，且具有劑量依賴性，其機制與調控NLRP3炎性體軸和NF-κB信號通路密切相關[22-23]。現階段已知中藥復方抗GA的研究中，NLRP3炎癥小體的相關上游信號通路受到影響，但中藥復方是否能直接結合NLRP3炎癥小體，有待進一步挖掘。

2.2 單味中藥提取物 與中藥復方相比，單味中藥成分相對清晰，對于中藥開發的進一步研究有著重要的作用。單味中藥既可以單獨發揮療效，同時也可以與其他藥物協同產生效應，因此單味藥研究是進一步研究的重要基礎。比如，牛膝總皂苷能夠有效地緩解GA模型小鼠的活動減少、關節腫脹等癥狀[24]。白芍總苷、土三七提取物能夠降低GA小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α的水平[25-26]。研究發現，畬藥三腳風爐水提物能夠調節NLRP3炎癥小體，抑制炎性因子IL-1β的表達[27]。GA模型小鼠活動量減少，關節浸出液中IL-1β、IL-6和IL-18水平顯著增高，炎性細胞浸潤明顯，滑膜組織中可見NLRP3、ASC、caspase-1前體和活性形式蛋白表達增高，而土茯苓總黃酮 （total flavonoids of Smilax glabra Roxb，TFSG）、虎杖醇提物（ethanolic extract of polygonum cuspidatum，PCE）對上述指標具有不同程度的改善作用，其作用機制可能與調控NLRP3/ASC/caspase-1信號通路有關[28-29]。野菊花提取物通過調節ASC磷酸化，同時抑制NLRP3和AIM2炎癥小體激活，從而能夠抑制促炎因子的分泌和中性粒細胞的募集[30]。對白子菜提取物改善GA的研究發現，IL-1β與caspase-1、ASC、NLRP3存在顯著相關性[31]。 這些實驗結果表明中藥單味藥提取物治療GA，與NLRP3炎癥小體密切相關。

2.3 中藥單體化合物 在中藥復方和中藥單味提取物的研究基礎上進一步研究中藥單體化合物，對于靶向治療及新藥開發意義重大。黃芩苷、姜辣素能夠抑制炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達，并減少大鼠踝關節炎性細胞浸潤[32-33]。橙皮苷甲基查爾酮對GA的抗炎作用依賴于抑制NF-κB信號通路的轉導調控[34]。青蒿素及其衍生物可下調經MSU晶體及LPS處理的巨噬細胞中NIMA相關激酶7（recombinant human NIMA-related kinase 7，NEK7）-NLRP3的相互作用，減少急性GA模型小鼠細胞中鉀離子外流[35-36]。通過檢測急性期痛風患者、間歇期痛風患者和健康體檢者的外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）數量，研究發現急性期和間歇期痛風患者外周血PBMCs的沉默信息調節蛋白1（sirtuin1，SIRT1）mRNA及蛋白水平均低于健康體檢者，NF-κB/p65 mRNA和IL-1β蛋白水平均高于健康體檢者。體外MSU干預PBMCs的實驗驗證，白藜蘆醇干預組的SIRT1蛋白水平顯著高于MSU組，NF-κB/p65 mRNA及IL-1β蛋白水平則顯著降低[37]，說明MSU晶體引起的炎癥和關節功能障礙，受到NF-κB信號通路的調控。研究發現，槲皮素能夠抑制NLRP3的上游信號傳導，通過抑制核因子-E2相關因子2（nuclear factor-E2 related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）信號來抑制炎癥，而HO-1小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）可消除槲皮素對NLRP3的抑制作用[38]，說明中藥單體化合物抗GA的機制與ROS的變化密切相關。進一步研究表明，姜黃素、綠茶中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯能夠抑制小鼠原代巨噬細胞線粒體DNA的合成和ROS的產生[39-40]。桉油醇能減輕MSU誘導的體內抗氧化酶活性的增加和ROS的降低；同時可減弱MSU誘導的踝關節組織和支配踝關節的背根節神經元的瞬時感受器電位香草酸受體1 （transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）表達上調，抑制NLRP3炎癥小體的生成，干預GA的進程[41]。冬凌草甲素能夠通過與NLRP3炎癥小體279位的半胱氨酸靶向結合，激活NLRP3的核苷酸偶聯結構域 （domain present in NAIP，CIITA，HET-E and TP1，NACHT），對其NLRP3-NEK7區域產生抑制作用，從而抑制NLRP3炎癥小體活化，其機制可能與抑制NLRP3炎癥小體裝配和激活有關[42-43]。黃連堿是中藥黃連的特征性成分，能夠與caspase-1特異性結合，是有效的caspase-1抑制劑[44]。大黃酸通過抑制NLRP3和ASC的聚集，影響NLRP3炎癥小體的形成，從而抑制caspase-1的表達及活性，最終阻止炎癥信號通路的激活，發揮防治GA的作用[45]。目前大黃酸已被國家科技部列為“十五”國家重大科技專項研究對象，證明中藥單體的研究正從實驗室走向臨床，也預示著中藥在控制病情發展、降低不良反應等方面的獨特優勢。因此，中藥有效單體的研究很可能成為未來抗痛風領域研究的熱點。

中藥復方、單味藥提取物及單體化合物干預NLRP3炎癥小體抗GA的進展總結見表1。

表1 中藥復方、單味藥提取物及單體化合物干預NLRP3炎癥小體抗GA的機制

3 討論

現階段針對NLRP3炎癥小體的相關機制研究包括ROS產生和線粒體功能障礙、氧化線粒體DNA釋放、鉀離子外流、破壞的溶酶體釋放組織蛋白酶B、細胞外鈣離子梯度的變化，磷酸化和泛素化以及跨膜孔的形成等方面。除此之外，NEK7、microRNAs誘導NLRP3炎癥小體失活也是研究重點[46]。黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）-NLRP3雙靶向抑制劑能夠同時降低尿酸和減輕炎癥，這可能是今后治療GA的一個有前途的方法[47]。

NLRP3炎癥小體在中醫藥治療GA中發揮了重要作用，但中藥復方成分復雜，因此尚未深入系統探討其機制，目前研究僅還局限在上調保護因子TGF-β1[18]、抑制NLRP3/NF-κB信號轉導[15]、抑制TLR/NF-κB信號轉導[16]等方面。經典方劑和民間醫藥往往具有更好的臨床基礎，療效顯著。目前以中藥有效提取物為基礎，進行“新配伍”的相關研究成為新熱點。單味中藥提取物成分相對于復方較少，成分更加明確，是進一步臨床研究必不可少的基礎。而部分中藥單體化合物，已被證明能夠與蛋白質活性部位結合從而發揮藥理作用，如：黃連堿通過與caspase-1活性部位結合，直接抑制NLRP3炎癥小體激活[44]；蒽醌類藥物大黃酸，雖不能直接影響NLRP3與ASC的表達，但是能夠阻止其聚集，從而發揮作用[45]。

中藥能夠通過干預NLRP3炎癥小體治療GA，但相關機制有待深入研究，NLRP3炎癥小體激活調控的過程中是否還有其他蛋白的介入也有待考證，因此未來研究的重要方向是進一步明確NLRP3炎癥小體相關通路之間的關系。同時在對GA進行研究的同時，應以NLRP3炎癥小體為核心，尋找治療相關并發癥的方法，并開發高效低毒的新藥。