氫氣水調控自噬對百草枯中毒大鼠肺纖維化的影響

劉永駿 ，王 穎 ，楊 眉 ，殷娥高 ，李 婷 ，董昭興

（1）昆明醫科大學第二附屬醫院呼吸與危重癥科一病區，云南 昆明 650101；2）云南師范大學校醫院，云南 昆明 650101；3）中國科學院大學寧波華美醫院，浙江 寧波 315000）

百草枯（paraquat，PQ）是一種全世界廣泛使用的廉價、有效且對環境無害的非選擇性除草劑，同時也是一種口服攝入致死率極高的毒藥[1]。PQ攝入后通過多胺轉運系統選擇性的在肺組織中聚集，通過炎性細胞浸潤、氧化應激、脂質過氧化等多種機制導致急性肺損傷和肺纖維化，最終導致患者死亡。盡管口服PQ中毒致死率超過90%，但目前尚無特效的治療辦法[2-3]。

肺纖維化是由多種原因導致的肺泡上皮細胞持續性損傷、肺泡異常修復以及細胞外基質沉積所導致[4]。自噬是機體維持細胞穩態的關鍵，研究發現自噬可以保護肺泡上皮細胞免受博萊霉素誘導的應激和凋亡，并調節炎癥[5]，相反自噬不足可加速肺泡上皮細胞衰老，誘導成纖維細胞向肌成細胞分化，促進肺纖維化的形成[6]。

分子氫因其可以迅速擴散到組織和細胞中發揮出強大的抗氧化、抗炎、抗凋亡作用，已被廣泛運用到多種疾病的治療中[7]。最近有多項研究報道了分子氫可以通過調控自噬來發揮對疾病的治療作用，但分子氫對自噬的調控作用尚無統一認識[8-11]。氫分子可以通過多種方式予以給藥，包括吸入氫氣、飲用氫氣水，氫生理鹽水腹腔注射等方式被廣泛用于動物研究[12-13]。本課題組前期研究發現了氫氣水可以通過調節Nrf2（nuclear factor-erythroid 2 related factor）發揮抗氧化作用從而減輕了肺纖維化[14]，但前期研究僅在體外實驗中進行驗證，暫無體內實驗支持，并且對于氫氣水治療肺纖維化作用的機制研究尚不足。

本研究旨在通過觀察氫氣水作用于PQ中毒的肺纖維化大鼠模型中自噬的變化，進一步通過體內實驗驗證氫氣水對于肺纖維化的治療作用，并且解釋氫氣水治療PQ所致肺纖維化的可能機制，為治療PQ所致肺纖維化開辟新的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

本試驗采用6～8周的雄性SD大鼠50只，體重（230 ± 30）g，飼養于22～24 ℃環境中，自由飲食飲水，光照周期為12 h。本實驗SD大鼠均由昆明動物研究所[許可證號：SCXK（滇）2016-0001]購買，經動物倫理審查通過后，適應性飼養1周。

主要試劑：百草枯（江蘇省先正達南通保護有限公司）、雷帕霉素（美國 Sigma公司）、使用制氫設備將氫氣在高壓（0.4 Mpa）下溶解于0.9%的鹽水中至飽和。4 ℃下滅菌保存于鋁袋中以備用，每周重新制備1次，確保濃度保持在0.6 mmol/L。一抗LC3、p62抗體（美國Proteintech公司）、βactin內參抗體、鼠/兔二抗（中國萬類生物公司）、PCR 引物（中國擎科生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物模型建立及分組（1）百草枯中毒大鼠模型建立方法：將SD大鼠頸部固定，暴露腹部，持灌胃針進入大鼠口腔，順著上顎到達食管，沿食管垂直進針3～4 cm，確定灌胃針進入大鼠胃部后根據分組給予不同處理。灌胃操作完成后，密切觀察大鼠有無呼吸困難、嘔吐等癥狀。灌胃1 h后根據不同分組進行相應的藥物處理，在模型建立第28天處死大鼠，取大鼠肺組織標本。由于百草枯毒性較大，死亡的大鼠需補齊至每組10只，處理方法同前。（2）將50只大鼠禁食10 h后，隨機的分為5組，每組10只大鼠。對照組：予等體積蒸餾水一次性灌胃；PQ染毒組：予百草枯50 mg/kg一次性灌胃；雷帕霉素治療組：予百草枯50 mg/Kg一次性灌胃并予雷帕霉素4 mg/（kg·d）腹腔注射；氫氣水治療組：予百草枯50 mg/Kg一次性灌胃并予氫氣水10 mL/（kg·d）腹腔注射；綜合治療組：予百草枯50 mg/kg一次性灌胃并予雷帕霉素4 mg/（kg·d）腹腔注射，間隔30 min后再次給予氫氣水10 mL/（kg·d）腹腔注射。

1.2.2 蘇木精-伊紅染色（HE染色）評定肺纖維化程度取大鼠右肺組織標本，經4%多聚甲醛固定1周后，經脫水、包埋、切片制成石蠟切片；將石蠟切片置于載玻片上脫蠟、水化后，予蘇木素染色30 s，流水沖洗5 min，伊紅染色30 s，再次流水沖洗5 min，最后放入透明劑中浸泡10 min透明化后予中性樹脂封片。光學顯微鏡下觀察大鼠肺組織形態變化。

1.2.3 馬松染色（Masson’s 染色）評定肺纖維化程度取大鼠右肺組織標本，經4%多聚甲醛固定1周后，經脫水、包埋、切片制成石蠟切片；將石蠟切片置于載玻片上脫蠟、水化后，予蘇木素染色5 min，酸性乙醇分化液分化5 s，流水沖洗5 min，Masson藍化液反藍3 min，蒸餾水沖洗5 min，予麗春紅品紅染色5 min，磷鉬酸溶液浸洗1 min，弱酸溶液浸洗1 min，苯胺藍染色1 min，再次弱酸溶液洗1 min，最后無水酒精以及二甲苯脫水后予中性樹脂封片。光學顯微鏡下觀察大鼠肺組織形態變化。

1.2.4 RT-PCR 技術檢測各組Col-I、Col-IImRNA的表達取大鼠右肺組織標本，加入1 mL Trizol充分研磨，冰上靜置裂解5 min，加入200 μL氯仿混勻后靜置5min。設置低溫冷凍離心機溫度為4 ℃，轉速為12 000 r/min，離心15 min，取上清液，加入等體積異丙醇，混勻后靜置15 min，再次使用低溫冷凍離心機離心15 min，棄上清液，使用75%酒精洗滌沉淀2次，晾干，加入超純水50 μL溶解獲得RNA提取物。將得到的RNA提取物進行逆轉錄，獲得相應的cDNA。將cDNA模版、上下游引物、2XTaqPCRMaster-mix混合后置于96孔板中，上機，設置反應程序95 ℃變性20 s，95 ℃變性1 s、60 ℃退火20 s，共循環40次。獲取各樣本中mRNA含量值，重復3次實驗，取平均值。

引物序列如下：

Col-IF：5′ AAAACGGGAGGGCGAGTG 3′

R：5′ CCATAGGACATCTGGGAAGCAA 3′

Col-IIIF：5′CTGGTTTCTTCTCACCCTGCTT 3′

R：5′ TTTGACATGGTTCTGGCTTCC 3′

1.2.5 Western blot 法檢測各組細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62蛋白的表達取大鼠右肺組織標本，加入500 μL Ripa充分研磨，冰上靜置裂解5 min。設置低溫冷凍離心機4 ℃ 12 000 r/min，離心15 min，取上清液。使用BSA法測定蛋白含量，將蛋白溶液混入緩沖液，沸水中煮15 min變性。根據蛋白含量，在SDS聚丙烯酰胺凝膠上加樣，電泳1 h，轉PVDF膜1 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗放置4 ℃冰箱孵育過夜，TBST洗膜3次后，加入二抗孵育1 h，再使用TBST洗膜3次后，予顯影劑上機顯影。使用ImageJ軟件以內參蛋白 β-actin 的比值作為半定量比較的依據，測定膜上圖像灰度值。

1.3 統計學處理

采用Graphpad Prism 5.0統計學軟件進行分析，數據采用均數±標準差（）表示，計量資料符合正態分布，采用單因素方差分析，選取Tukey’s Multiple Comparison Test進行組間差異性分析，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色及Masson’s 染色結果

大鼠肺組織病理切片HE染色顯示，PQ染毒組標本表現出肺泡結構大面積破壞，肺泡間隔明顯增厚，炎性細胞大量浸潤，形成斑片狀纖維化病灶；雷帕霉素治療組和氫氣水治療組也表現出了肺泡結構破壞，肺泡間隔增厚，炎性細胞浸潤，但較PQ組表現較輕；綜合治療組對比對照組標本的上皮細胞脫落和肺泡間隔增厚、炎性細胞浸潤表現更輕，程度介于對照組和氫氣水治療組或雷帕霉素治療組之間，見圖1A。

大鼠肺組織病理切片Masson’s 染色顯示，PQ染毒組表現出肺泡結構完全丟失，大量膠原堆積在肺泡間隔中，膠原染色明顯；氫氣水治療組和雷帕霉素治療組膠原染色陽性率下降，肺泡結構丟失但較PQ染毒組輕；綜合治療組膠原染色陽性率顯著下降，肺泡組織結構與氫氣水治療組或雷帕霉素治療組相比更加完整，見圖1B。

圖1 肺組織染色結果（× 200）Fig.1 Lung tissue staining（× 200）

2.2 RT-PCR測定Col-I和Col-IIImRNA結果

PQ染毒組大鼠肺組織中的Col-ImRNA表達與對照組相比顯著升高（P＜ 0.01），經氫氣水治療后Col-ImRNA表達下降（P＜ 0.05），雷帕霉素治療組和綜合治療組Col-I mRNA表達較氫氣水治療組更低（P＜ 0.01），且二者表達量，差異無統計學意義（P＞ 0.05），見圖2A。

PQ染毒組大鼠肺組織中Col-IIImRNA表達與對照組相比顯著升高（P＜ 0.01），經氫氣水治療后Col-IIImRNA表達下降（P＜ 0.05），雷帕霉素治療組較氫氣水組Col-IIImRNA表達低（P＜ 0.05），但二者差異無統計學意義（P＞ 0.05），綜合治療組Col-IIImRNA表達最低（P＜ 0.01），見圖2B。

圖2 不同處理組Col-ImRNA和Col-IIImRNA的表達Fig.2 Expression of Col-I mRNA and Col-III mRNA in lung tissues in different groups

2.3 Westernblot測定LC3-I、LC3-II和p62結果

在Westernblot測定大鼠肺組織中P62表達時發現，與對照組相比，PQ染毒組中P62表達顯著上升（P＜ 0.001），與PQ染毒組相比，氫氣水治療組P62表達下降（P＜ 0.05），雷帕霉素和綜合治療組P62表達較PQ染毒組顯著下降（P＜ 0.01），且二者差異無統計學意義（P＞ 0.05），見圖3A、圖3B。

在Westernblot測定大鼠肺組織中LC3表達，通過計算LC3-II/LC3-I比值觀察自噬流變化，結果顯示與對照組相比，PQ染毒組LC3II/I比值降低（P＜ 0.05）；與PQ染毒組相比，氫氣水治療LC3II/I值上升（P＜ 0.05），雷帕霉素治療組較PQ染毒組LC3II/I值上升（P＜ 0.01），綜合治療組LC3/II/I值較PQ染毒組顯著上升（P＜ 0.001），見圖3A、圖3C。

圖3 不同處理組P62的表達和LC3-II/LC3-I比值變化Fig.3 Expression of P62 and change of LC3-II/LC3-I ratio in different treatment groups

3 討論

分子氫作為氣體小分子，可以在組織和細胞中快速擴散發揮作用。在室溫和大氣壓下，分子氫可以溶解于水中，形成氫氣水，并且飲用氫氣水與吸入氫氣作用相當[7]。盡管目前氫氣水治療作用的研究著重于抗氧化和抗凋亡作用方面，但越來越多的研究報道了氫氣水可以通過調控自噬對抗多種疾病進程，包括心肌缺血/再灌注損傷[9]、急性腎損傷[10]、急性肺損傷[15-16]等。PQ所致的肺纖維化中自噬被激活還是抑制，目前研究尚存爭議，Yao等[17]的研究報道了對于16HBE細胞，低劑量的PQ可以激活自噬，而高劑量PQ卻抑制了自噬；Gxu等[18]的研究報道了急性PQ中毒致死的肺纖維化患者的肺組織中纖維化區域的細胞自噬功能障礙，自噬在PQ誘導肺纖維化形成的過程中起到了重要作用。根據本實驗，得到以下結論：（1）百草枯染毒誘導大鼠肺纖維化形成并抑制了自噬。本研究采用病理組織切片及RT-PCR檢測膠原蛋白的轉錄水平來評判肺纖維化程度。根據百草枯染毒后大鼠肺組織出現了急性肺損傷及肺纖維化表現，檢測Col-Ⅰ mRNA及Col-ⅢmRNA的表達水平上升，證明本實驗中百草枯誘導大鼠肺纖維化形成。通過WesternBlot檢測自噬相關蛋白LC3，與對照組相比，PQ組的LC3II/I比值無統計學差異，但P62表達升高，考慮PQ所致肺纖維化中的自噬流發生障礙，自噬被抑制[19]。（2）雷帕霉素激活自噬并減輕了百草枯誘導的大鼠肺纖維化。使用雷帕霉素治療后，觀察PQ染毒組大鼠的肺組織病理切片，與PQ組相比，發現雷帕霉素治療組大鼠的肺組織結構破壞減輕，Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA表達較PQ組下降，提示大鼠肺纖維化減輕。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ較PQ組上升，P62表達下降，提示自噬受到促進。結果還顯示雷帕霉素促進自噬作用優于氫氣水。（3）氫氣水減輕了百草枯誘導的大鼠肺纖維化并促進了自噬。使用氫氣水治療后，觀察PQ染毒組大鼠的肺組織病理切片，與PQ組相比，發現氫氣水治療組大鼠的肺組織結構破壞減輕，同時檢測Col-Ⅰ mRNA、Col-Ⅲ mRNA表達下降，提示大鼠肺纖維化減輕，WesternBlot檢測自噬相關蛋白LC3，計算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較PQ組上升，P62表達下降，提示大鼠肺組織中自噬流增加，自噬功能障礙得到改善。（4）氫氣水聯合雷帕霉素治療百草枯誘導的肺纖維化優于二者單用，將氫氣水與雷帕霉素合用于治療PQ所致大鼠肺纖維化后，肺組織結構破壞比單用雷帕霉素或氫氣水治療更輕，Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA表達較單用雷帕霉素或氫氣水組更低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p62表達水平均反應出綜合治療組自噬水平高于雷帕霉素或氫氣水單用治療組。

以上實驗驗證了自噬與PQ所致肺纖維化存在密切關系，PQ所致肺纖維化中存在自噬功能的障礙；通過促進自噬，恢復自噬功能，可以減輕PQ所致大鼠的肺纖維化程度；氫氣水可以促進自噬，部分恢復自噬功能，從而減輕PQ所致的肺纖維化，為肺纖維化的治療提供了新的思路。

目前研究認為肺纖維化的發病機制復雜[20]，本實驗僅用百草枯進行肺纖維化造模存在局限性，還需在其他因素誘導肺纖維化模型中加以印證。另外，大鼠肺纖維化模型中同一部位肺纖維化程度不一至，檢測結果可能存在一定誤差。最后，在既往研究顯示氫氣水可以通過多種途徑調節自噬[8-11]，本實驗中氫氣水究竟通過何種機制調控自噬治療肺纖維化尚不清楚，需后期研究進一步深入。