動態監測食管癌患者手術及化療前后T淋巴細胞亞群及NK細胞水平變化的意義

張輔君 ，龔 容

（1）昆明醫科大學第一附屬醫院老年胸外科；2）云南省檢驗醫學重點實驗室，云南省實驗診斷研究所，昆明醫科大學第一附屬醫院檢驗科，云南 昆明 650032）

近年來，隨著食管癌的免疫治療研究的逐步推進，免疫檢查點抑制劑已被批準用于食管癌的二線或三線療法，越來越多的患者開始接受化免聯合或序貫治療。但既往的多數研究認為化療對機體免疫系統會產生抑制作用，其中以T淋巴細胞數量與功能的下降最為明顯[1]，而在免疫治療中起關鍵作用的程序性細胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）和細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）均與T淋巴細胞密切相關，是重要的抑制性表面標志物。國外多項研究表明[2-4]若腫瘤抗原特異性T淋巴細胞數量減少，作為直接的臨床結果，則表現出患者對PD1/PDL-1途徑免疫治療的反應較差。因此動態監測患者的T淋巴細胞亞群及NK細胞水平指標，以了解患者的免疫狀態對后續免疫治療有重要意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2018年1月至2020年12月于昆明醫科大學第一附屬醫院住院的食管癌手術+化療治療的患者，納入標準：（1）入院前無手術、放療、化療、免疫治療史；（2）術前經胃鏡活檢確診為食管惡性腫瘤[5]；（3）術后均有明確的病理診斷及TNM分期。排除標準：（1）存在嚴重損害免疫功能的疾病如獲得性免疫缺陷綜合征、系統性紅斑狼瘡、慢性乙型病毒性肝炎等；（2）近期存在明確感染史；（3）近期使用過胸腺肽等免疫增強劑。最終入組39例，年齡42～70歲，其中男性37例，女性2例。病理組織類型分布：39例均為鱗癌，分化程度：低分化9例，中-低分化19例，中分化10例，中高分化1例。根據食管癌TNM分期（UICC/AJCC 2017第8版）[6]：Ⅱ期29例，Ⅲ期10例。

同時隨機選取39例同期體檢者作為正常對照組，年齡35～72歲，平均59歲，其中男性35例，女性4例，見表1。

表1 患者基本信息（n）Tab.1 Clinical and pathological characteristics of patients enrolled in the study（n）

1.2 臨床資料處理流程

患者入院后行開胸手術切除食管病變+胃代食管吻合術+淋巴結清掃術，術后禁食7 d，予全腸外營養治療。7 d后復查食道造影，1例出現食管吻合口瘺，造成化療時間推遲4周，其余病例均按期（術后3～4周）接受化療治療。化療方案選擇：奧沙利鉑+紫杉醇。

所有患者均在不同時間點：手術前（入院時）、手術后3 d、手術后7 d、化療第一周期前（即術后第3～4周）、化療后1周、化療后3周空腹采集3～4 mL EDTA抗凝全血，用于檢測外周血T淋巴細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）及NK細胞絕對計數。

1.3 檢測方法及試劑

外周血T淋巴細胞亞群和NK細胞百分比應用流式細胞術進行分析。采用美國BD FACS Calibur流式細胞儀和配套的淋巴細胞亞群檢測試劑盒（Multi TEST IMK Kit）由專業檢驗人員嚴格按照操作流程檢測。

1.4 統計學處理

采用SPSS 22.0統計軟件分析數據，食管癌組術前與正常對照組之間的比較采用t檢驗分析；不同時間點T淋巴細胞亞群變化情況采用重復測量的方差分析，進一步多重比較采用LSD法，結果以Mean ±SD表示。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 食管癌組手術前與正常對照組T淋巴細胞亞群及NK細胞水平比較

食管癌組患者術前CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK細胞水平顯著低于正常對照組（P＜ 0.05），而CD8+的水平高于正常對照組，見表2。

表2 食管癌組術前與對照組T細胞亞群及NK細胞水平的比較（）Tab.2 The proportions of lymphocytes subsets and the levels of NK cells in healthy controls and in patients with esophageal cancer before surgery（）

表2 食管癌組術前與對照組T細胞亞群及NK細胞水平的比較（）Tab.2 The proportions of lymphocytes subsets and the levels of NK cells in healthy controls and in patients with esophageal cancer before surgery（）

2.2 食管癌組術后T淋巴細胞亞群及NK細胞水平變化情況

術后第3天、第7天患者外周血T淋巴細胞各亞群及NK細胞水平均較術前明顯下降（P＜0.05），且在術后第3天為最低值，隨后逐漸升高，直至化療第1周期前（即術后第3～4周）恢復至接近術前水平。CD4+/CD8+在患者手術前后直至化療第1周期前均無明顯變化，見表3、圖1。

圖1 食管癌組術前、術后T細胞亞群及NK細胞水平變化趨勢圖Fig.1 The trend of T lymphocyte subsets and the levels of NK cells before and after surgery

表3 食管癌組術前、術后T細胞亞群及NK細胞水平的變化（）Tab.3 The proportions of lymphocytes subsets and the levels of NK cells before and after surgery（）

表3 食管癌組術前、術后T細胞亞群及NK細胞水平的變化（）Tab.3 The proportions of lymphocytes subsets and the levels of NK cells before and after surgery（）

與手術前比較，*P ＜ 0.05。

2.3 食管癌組化療后T淋巴細胞亞群及NK細胞水平變化情況

與化療前相比，食管癌組患者化療后1周CD3+、CD4+及CD4+/CD8+升高，而CD8+比例下降，差異具統計學意義（P＜ 0.05）。化療后3周各T淋巴細胞亞群比例與化療前基本相同。化療前后NK細胞水平雖表現出與CD3+、CD4+類似的變化趨勢，但差異無統計學意義（P＞ 0.05），見表4、圖2。

表4 食管癌組化療前后T細胞亞群水平的變化（）Tab.4 The proportions of T lymphocyte subsets and NK cells in patients with esophageal cancer before and after chemotherapy（）

表4 食管癌組化療前后T細胞亞群水平的變化（）Tab.4 The proportions of T lymphocyte subsets and NK cells in patients with esophageal cancer before and after chemotherapy（）

與化療前比較，#P ＜ 0.05。

圖2 食管癌組化療前后T細胞亞群及NK細胞水平變化趨勢圖Fig.2 The trend of T lymphocyte subsets and the levels of NK cells before and after chemotherapy

3 討論

大量研究表明在抗腫瘤的免疫反應中以細胞免疫為主，T淋巴細胞和NK細胞在其中具有重要作用。當T淋巴細胞亞群數量、功能發生改變，CD4+、CD8+平衡被打破，機體免疫系統紊亂，識別和殺傷惡性細胞的能力降低，這可能是導致癌癥發生的免疫機制之一。在本研究中，治療前食管癌組外周血CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+、NK細胞顯著低于對照組，說明食管癌患者的免疫功能受到抑制，清除腫瘤細胞的能力已較正常人群減弱。在其他研究者的實驗中[7-8]還發現：腫瘤分期越晚，免疫功能受到抑制的程度也越嚴重，這使得監測T淋巴細胞亞群及NK細胞的數量，具有協助判斷腫瘤分期、評估治療效果的指導意義。

在國內外的大多數報道中[9-13]，手術對機體免疫狀態的影響多是抑制性的，其原因包括術中失血、麻醉鎮痛、手術創傷等等，其機制包括手術應激、T淋巴細胞壞死、免疫炎性反應等。在本研究中，雖然觀察到術后CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞水平的顯著下降，但手術前后CD4+/CD8+卻沒有明顯變化，這說明食管癌手術后外周血淋巴細胞總數量的下降可能才是導致機體免疫功能降低的主要原因。另外，在本研究中，T淋巴細胞亞群和NK細胞水平在術后3 d開始恢復，3～4周才恢復至接近術前水平，與其他研究者在肺癌、乳腺癌患者中的研究相比，食管癌患者術后免疫功能的恢復時間較長（肺癌患者平均7 d，乳腺癌患者平均5 d）[13-14]，推測原因可能是食管癌手術時間長，創傷較大，術后長時間禁食所導致機體免疫功能恢復緩慢，所以盡量縮短術后禁食時間、加用免疫調節劑或許能夠促進術后免疫功能的恢復。

在食管癌的綜合治療中，化療一直是重要的組成部分。雖然化療能夠殺傷大量腫瘤細胞、減少腫瘤負荷，但同時也能夠破壞機體免疫系統、骨髓等造血系統，抑制DC等免疫細胞的產生。這使得化療與免疫治療在聯合使用時，其使用先后順序、同步或序貫產生了爭議。本研究觀察到患者化療后短時間內CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+升高，而CD8+比例下降，說明免疫狀態有所改善，這可能是由于化療殺傷腫瘤細胞后，緩解了由腫瘤細胞直接誘導的免疫抑制。在化療后3周各T淋巴細胞亞群比例已恢復至接近化療前水平，這可能支持化療與T細胞依賴性免疫治療在同步或序貫方案中有效結合的想法。

綜上所述，食管癌患者的免疫功能在治療前后及治療后的不同時間段均會發生改變，但由于檢測方法的區別、人種的差異、腫瘤類型的不同，導致國內外報道中T淋巴細胞亞群及NK細胞變化趨勢的不一致，甚至得出相反的結果，因此針對患者個體進行T淋巴細胞亞群及NK細胞的連續動態監測顯得尤為重要，相較單次檢測不僅能夠更加準確地反映患者所處的免疫狀態，還為后續免疫治療提供依據。

本研究不足之處：（1）血液中的CD4+、CD8+還包含有其他更小的亞群，各個亞群的功能及特征均不相同，僅上述抗原還不足以準確描述手術及化療對淋巴細胞亞群的影響；（2）在39例患者中，10例接受了額外的放射治療，可能導致T細胞亞群數量的改變，故僅選取了化療一周期后數據，使得本研究結果不能完全反映長期化療后的情況。但在Krijgsman等[15]的研究中，實體瘤患者在進行4～6個周期的化療后，與治療前相比，B細胞變化顯著，而T和NK細胞計數無明顯變化。這可能支持本研究僅選擇化療一周期后數據的方案設計；（3）由于條件有限，未能進行NK細胞活性測定，在Ogura[16]的研究中發現化療藥物對NK細胞的作用根據疾病類型和化學治療強度而變化，NK細胞的數量與活性并不一定同步增加或減少。這使得僅檢測NK細胞數量無法準確反映NK細胞的免疫狀態。