hiPSC-ACM和hiPSC-VCM進(jìn)行藥物毒性檢測(cè)的效果研究

孫瑩

（廣東司法警官職業(yè)學(xué)院司法鑒定中心，廣東 廣州 510520）

0 引言

當(dāng)前藥物的毒性評(píng)價(jià)主要包括動(dòng)物模型、動(dòng)物原代心肌細(xì)胞等，通量較低，在實(shí)際應(yīng)用中存在種屬差異，影響毒性評(píng)價(jià)結(jié)果[1]。人源性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化心房肌細(xì)胞（hiPSC-ACM）和心室肌細(xì)胞（hiPSC-VCM）與人體心肌細(xì)胞特征相同，避免了種屬差異問題，能夠無限增殖，縮短藥物研發(fā)成本和時(shí)間，為藥物毒性高通量篩查提供了重要的參考依據(jù)[2]。為了探討體外評(píng)價(jià)心臟藥物毒性的有效方法，本文就hiPSC-ACM和hiPSCVCM進(jìn)行藥物毒性檢測(cè)的效果進(jìn)行了探索。

1 資料與方法

1.1 一般資料。中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供的hiPSC細(xì)胞系；美國Sigma公司提供的全反式視黃酸（RA）、RA通路抑制劑、鼠抗輔肌動(dòng)蛋白（α-acti nin）；BIOBASE酶標(biāo)儀；賽默飛Attune NxT流式細(xì)胞儀；BiO-Rad公司提供的無血清培養(yǎng)基、PBS溶液；翌圣生物科技（上海）有限公司提供的鈣敏染料；美國Abcam公司提供的兔心室特異性標(biāo)志物（MLC2v）抗體；BIO-RAD TC20自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器。

1.2 方法。通過培養(yǎng)hiPCS細(xì)胞，用RA處理作為RA組，用RA抑制劑處理作為RAi組。待細(xì)胞分化到12～16 d時(shí)更換成純化液，如可見成纖維細(xì)胞脫落則提可終止純化過程，改為2%心肌培養(yǎng)基，隔日換液。使用細(xì)胞免疫熒光染色法、流式細(xì)胞法測(cè)定α-actinin、cTnT、MLC2v，使用Trizol法完成細(xì)胞RNA提取操作，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定MLC2v、MYH7、NR2F2、KCNA5表達(dá)。采用細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)、鈣離子熒光探針檢測(cè)細(xì)不同濃度特非那定、索他洛爾培養(yǎng)24 h后的hiPSCACM、VCM細(xì)胞活性和鈣瞬變。

1.3 觀察指標(biāo)。比較兩組細(xì)胞的心肌細(xì)胞純度；比較兩組心室肌細(xì)胞、心房肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量；分析特非那定、索他洛爾在不同濃度下對(duì)hiPSC-ACM、VCM細(xì)胞活性和細(xì)胞鈣瞬變的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將數(shù)據(jù)錄至SPSS 23.0，以χ2檢驗(yàn)定性資料（%、n），以t檢驗(yàn)定量資料（±s），P＜0.05，提示有差異。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞的心肌細(xì)胞純度比較。RA組cTnT陽性率為99.00%，RAi組為98.84%，兩組細(xì)胞的心肌細(xì)胞純度＞95%。兩組細(xì)胞經(jīng)免疫熒光雙染MLC2v、α-actinin處理后，可見兩組細(xì)胞均呈α-actinin表達(dá)，其中RA組M LC2v陽性率為6.42%，RAi組為94.56%，后者M(jìn)LC2v表達(dá)陽性率高于前者。RA組分化的細(xì)胞90%以上為hiPSCACM，RAi組分化的細(xì)胞90%以上為hiPSC-VCM。

2.2 兩組心室肌細(xì)胞、心房肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量對(duì)比。RA組MLC2v、MYH7相對(duì)表達(dá)量低于RAi組，RA組NR2F2、KCNA5相對(duì)表達(dá)量高于RAi組，詳見表1。

表1 兩組心室肌細(xì)胞、心房肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量對(duì)比（±s）

表1 兩組心室肌細(xì)胞、心房肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量對(duì)比（±s）

注：★P＜0.05。

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2.3 特非那定在不同濃度下對(duì)hiPSC-ACM、VCM細(xì)胞活性和細(xì)胞鈣瞬變的影響。藥物濃度為100.00 μmol/L時(shí)，兩種細(xì)胞活性明顯降低。兩種細(xì)胞的鈣瞬變振幅在低濃度50 nmol/L時(shí)明顯降低，見表2。

表2 特非那定在不同濃度下對(duì)hiPSC-ACM、VCM細(xì)胞活性和細(xì)胞鈣瞬變的影響（±s）

表2 特非那定在不同濃度下對(duì)hiPSC-ACM、VCM細(xì)胞活性和細(xì)胞鈣瞬變的影響（±s）

注：培養(yǎng)24 h后進(jìn)行比較；★P＜0.05。

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2.4 索他洛爾在不同濃度下對(duì)hiPSC-ACM、VCM細(xì)胞活性和細(xì)胞鈣瞬變的影響。濃度為1.00 μmol/L時(shí)兩種細(xì)胞活性明顯降低，低濃度1 μmol/L時(shí)ACM細(xì)胞鈣瞬變振幅明顯降低，VCM細(xì)胞的鈣瞬變振幅隨著藥物濃度的增長(zhǎng)并未發(fā)生明顯變化，見表3。

表3 索他洛爾在不同濃度下對(duì)hiPSC-ACM、VCM細(xì)胞活性和細(xì)胞鈣瞬變的影響（±s）

表3 索他洛爾在不同濃度下對(duì)hiPSC-ACM、VCM細(xì)胞活性和細(xì)胞鈣瞬變的影響（±s）

注：培養(yǎng)24 h后進(jìn)行比較；★P＜0.05。

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3 討論

RA信號(hào)途徑在心臟祖細(xì)胞發(fā)育、分化過程中具有重要的作用。相關(guān)報(bào)道顯示，RA在早期發(fā)育期間能夠促進(jìn)肝細(xì)胞向心房肌樣細(xì)胞方向分化，在體外誘導(dǎo)分化中得到了廣泛應(yīng)用[3]。本次研究結(jié)果顯示，RA組cTnT陽性率為99.00%，RAi組cTnT陽性率為98.84%，說明兩組心肌細(xì)胞純度較高，其中RAi組MLC2v陽性率高于RA組，且RA組分化的細(xì)胞90%以上為hiPSC-ACM，RAi組分化的細(xì)胞90%以上為心室肌細(xì)胞（hiPSC-VCM），說明RA在心肌分化過程中可調(diào)控心肌亞群向心室或心房方向分化，作用有效率較高。且RA組MLC2v、MYH7相對(duì)表達(dá)量低于RAi組，RA組NR2F2、KCNA5相對(duì)表達(dá)量高于RAi組，提示RAi可促進(jìn)hiPSCs向VCM分化，RA可促進(jìn)hiPSCs向ACM分化[4]。

抗組胺藥物特非那定、非選擇性β受體抑制劑均為致心律失常藥物，對(duì)人體心臟具有一定的毒性。本文中特非那定濃度為100 μmol/L時(shí)hiPSC-ACM、hiPSCVCM兩種細(xì)胞活性明顯降低，可見特非他定對(duì)心肌毒性較大，用藥安全窗較窄，在低濃度50 nmol/L時(shí)兩種細(xì)胞的鈣瞬變振幅明顯降低，且hiPSC-VCM細(xì)胞的鈣瞬變振幅會(huì)隨著藥物濃度的增長(zhǎng)而逐步下降。索他洛爾濃度為1.00 μmol/L時(shí)兩種細(xì)胞活性顯著下降，且隨著濃度的升高細(xì)胞活性會(huì)隨之降低，但細(xì)胞活性降幅較小，提示索他洛爾對(duì)心肌細(xì)胞的毒性較小，安全窗較寬，在低濃度1 μmol/L時(shí)hiPSC-ACM細(xì)胞的鈣瞬變振幅明顯降低，而hiPSC-VCM細(xì)胞的鈣瞬變振幅隨著藥物濃度的增長(zhǎng)并未發(fā)生明顯變化，表明索他洛爾對(duì)心房肌細(xì)胞鈣活動(dòng)的影響更加明顯[5-6]。

綜上所述，hiPSC-ACM、hiPSC-VCM可能通過調(diào)控RA通道分化的心室、心房肌細(xì)胞建立體外毒性評(píng)價(jià)模型，通過檢測(cè)兩種細(xì)胞的鈣瞬變、細(xì)胞活性可為醫(yī)師評(píng)價(jià)藥物毒性提供重要的參考依據(jù)。