耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因分布特征及其機制探討

汪玉龍，周鵬鵬，郝維敏

（安徽醫科大學附屬宿州醫院，安徽 宿州 234000）

0 引言

肺炎克雷伯菌（KPN）屬革蘭陰性腸桿菌科細菌，常定植在住院患者的腸道和呼吸道內，引起消化道、呼吸道、泌尿道、血液、顱內、手術切口及皮膚軟組織等部位的感染，現已成為院內感染重要的致病菌之一[1]。近年來廣譜抗生素的廣泛應用和超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）的產生，導致KPN對一線、二線抗菌藥物及β-內酰胺類抗生素的耐藥性不斷增加。2013年美國疾病預防控制中心（CDC）報告顯示耐藥的淋球菌、耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌和艱難梭菌已成為目前對公眾健康威脅最大的3種細菌[2-3]。國內耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）于2007年由浙江大學學者首次發現報道，此后十多年各地陸續出現相關報道，由CHINET和Mohnanarin全國細菌耐藥檢測結果可見，CRKP的檢出率由2011年的3.2%升至2015年的7.6%，2015年上海市CRKP檢出率更是達到20%。造成KPN對碳青霉烯類抗生素耐藥的因素較多，了解CRKP耐藥基因分布及其耐藥機制，通過脈沖場凝膠電泳進行同源性分析以及MLST的細菌分型方法進行流行病學分析進一步了解該院情況，對解決細菌耐藥問題及指導臨床合理用藥及預防院內流行爆發具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料。收集該院2019年1月至2020年12月臨床標本分離得到的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌80株，去除重復株。質控菌株肺炎克雷伯菌（ATCC 1705、ATCC 1706）和大腸埃希菌（ATCC 25922、ATCC 8739）均由衛生部臨床檢驗中心提供。陽性對照菌株KPC-2、TEM、NDM-1均來自該院檢驗科。

1.2 主要儀器及試劑。MH平板、BP平板、MAC平板、VITEK 2 COMPACT自動微生物分析儀、革蘭陰性菌鑒定藥敏卡均購于法國梅里埃公司，PCR擴增儀購于美國賽默飛公司 ，瓊脂糖及引物序列均由上海生工生物公司提供，DNA marker及Premix TaqTM均由日本TaKaRa公司提供，脈沖場凝膠電泳儀、凝膠成像系統來自北京君益東方公司，藥敏紙片由英國Oxoid公司提供。

2 研究方法

2.1 藥敏測定。嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》進行分離培養所得臨床菌株并應用VITEK 2 COMPACT自動微生物分析儀進行菌株鑒定及藥敏試驗，同時用紙片擴散法進行補充。結果判讀依照2020版CLSI標準判讀。

2.2 基因擴增。提取待測菌株DNA，引物見表1，PCR擴增體系為2×TaqPCRGreenMix（12.5 ul），模板（2.5 ul），上下游引物各1ul，DD H2O（8 ul），共25 ul的PCR反應體系。按照查閱的擴增條件進行擴增，并將擴增產物放在凝膠成像儀中觀察記錄。

2.3 PFGE檢測。調待測菌懸液濃度在3.8個麥氏點左右，加入1% Seakem Gold SDS膠制備膠塊，再用蛋白酶K進行裂解消化，純水清洗2遍再用TE清洗4次每次15 min左右并進行酶切孵育，按照參考文獻電泳條件進行實驗，并將結果進行聚類分析[4-5]。

2.4 MLST分型。查閱MLST分型資料得知肺炎克雷伯含有7個管家基因（gap、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB），并進行擴增，對擴增產物進行測序分析。最后將測序結果在肺炎克雷伯MLST數據庫進行比對確定序列型，詳情見表1。

表1 PCR引物序列

3 結果

3.1 菌株分布。80株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯標本類型占比分別為：痰液45株（56.2%）、尿液12株（15%）、導管尖7株（8.7%）、引流液10株（12.5%）、血液6株（7.5%）。

3.2 藥敏結果。藥敏試驗顯示，CRKP對阿米卡星敏感率為51.7%，對環丙沙星、左旋氧氟沙星、復方新諾明、哌拉西林/他唑巴坦等常見抗生素均具有較高耐藥率（＞70%），對頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢替坦及頭孢吡肟耐藥率為100%，詳見表2。

表2 80株菌株對常見抗生素藥敏情況

3.3 耐藥基因檢測結果。80株菌中檢測出有64株攜帶KPC-2基因（80%），4株攜帶NDM-1基因（5%），產KPC型肺炎克雷伯菌有53株攜帶TEM基因（82.8%）,未發現新的基因亞型。部分電泳結果見圖1。

圖1 部分菌株KPC基因PCR擴增電泳圖

3.4 PFGE分型結果。將80株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌進行脈沖場凝膠電泳，分析結果可把80株CRKP分為A1～A17不同帶型，其中A10帶型占比最多為16株，其次是A14為14株，每種帶型都包括1株到多株菌不等。在A10帶型中菌株16、77、50、36、75均來自該院ICU病房，可見存在一定的小范圍菌株流行情況，

3.5 MLST分型。PFGE聚類分析和MLST分析顯示產KPC-2型菌株主要為ST11型和ST395型，產NDM-1型菌株為ST263-F型和ST15-C型。ST11是主要型，占比81.3%（65/80）。其中ST526，ST45，ST395，只測得各1株，ST258，ST307檢測出3株。

4 討論

目前臨床應用的所有β-內酰胺類抗菌藥物中碳青霉烯類抗菌藥物抗菌活性最為廣泛，對產AmpC酶和ESBLs的革蘭陰性菌具有較好的治療效果，是目前革蘭陰性菌治療效果最強的β-內酰胺類藥物[6]。但隨著近年來藥物在臨床的應用，細菌耐藥的相關逐漸增多。碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的機制主要包括以下幾個方面：①碳青霉烯酶的產生，按照氨基酸序列的相似程度，可將其分為四類，A、B、D類碳青霉烯酶均具有水解碳青霉烯的活性，A類酶將導致細菌對頭孢菌素、青霉素、氨曲南和碳青霉烯類耐藥，腸桿菌科細菌中A類酶主要包括IMI、KPC及部分GES類型；B類酶為金屬β-內酰胺酶（即金屬酶），能夠水解除單酰胺環類外的全部β-內酰胺類抗菌藥物，主要包括VIM、NDM及IMP；D類酶能夠水解氯唑西林和苯唑西林，多見于假單胞菌屬、不動桿菌屬及腸桿菌科，目前肺炎克雷伯菌中主要為OXA-48型[7-8]。②外膜孔蛋白的缺失或表達水平下降，革蘭陰性菌外膜的蛋白通道是抗菌藥物進入細菌的重要途徑，膜孔蛋白能夠特異性導入β-內酰胺類抗菌藥物，當外膜孔蛋白缺失或表達水平下降時，導致其通透性改變，抗菌藥物無法進入細菌發揮作用[9-10]。CRKP相關外膜孔蛋白主要包括OmpK35、OmpK36、OmpK37。OmpK35和OmpK36蛋白的缺失或表達水平的下降將導致細菌對抗菌藥物敏感性降低，OmpK37常處于休眠狀態，僅在OmpK35和OmpK36蛋白缺失時會上調表達水平，OmpK37高表達時碳青霉烯最低抑菌濃度將下降，OmpK37蛋白缺失或表達水平下降時，即出現細菌耐藥[11-12]。③靶位蛋白改變，青霉素結合蛋白（PBPs）是β-內酰胺類作用的靶點，PBPs結構改變時與β-內酰胺類抗菌藥物親和力降低或不結合，對細胞壁合成粘肽的阻礙作用減弱或消失，對細菌細胞壁的破壞作用降低，出現耐藥[13-14]。目前研究主要發現PBP2位點減少或缺失，但不排除其他位點對碳青霉烯耐藥的影響，仍需進一步研究[15]。④主動排外機制，細菌外排泵能主動將抗菌藥物排出至菌體外，導致菌體內藥物濃度降低，產生耐藥性。AcrAB-TolC是肺炎克雷伯菌最主要的外排泵，有研究指出外排泵導致耐藥性的產生與外膜通透性間具有一定關系，菌體主要外排抗菌藥物的速度超過藥物通過外膜孔蛋白進入菌體的速度時將表現為細菌耐藥，否則菌體仍對藥物敏感[16]。

CRKP對大多抗菌藥物耐藥，僅有少數抗菌藥物能夠發揮作用。本研究中80株CRKP對阿米卡星敏感率為51.72%，對環丙沙星、左旋氧氟沙星、復方新諾明、哌拉西林/他唑巴坦等常見抗生素均具有較高耐藥率（＞70%），對頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢替坦及頭孢吡肟耐藥率為100%，大大增加了臨床治療難度。本研究選取80株CRKP菌株，由此可見CRKP因攜帶不同碳青霉烯酶基因而呈現不同基因分型[17-18]。

因菌株的耐藥性，基因型及流行分布會因地域或時間不同而存在差異，此次研究對了解該院的情況有重要意義，從檢測的基因結果表明該院耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌主要攜帶KPC-2基因，檢出率為80%，肺炎克雷伯菌耐藥機制最主要就是產KPC酶，以KPC-2為主，較國內其他地區研究相似。接下來會進一步從轉座子，質粒介導等方面進一步研究菌株耐藥基因的水平傳播，這也是引起院內感染爆發的原因[19]。從同源性分析來看在A10帶型中菌株16、77、50、36、75均來自該院ICU病房，可見該院存在小部分流行爆發情況，應引起該院重視采取合理有效地措施進行防止菌株流行的延續。有研究表明產NDM 陰溝腸桿菌MLST主要為ST93型[20]。該院研究有2株攜帶TEM基因的菌株的分型分別為ST258，ST307，可見相同耐藥基因會有不同的分型，這也是耐藥機制的復雜性之一，也進一步完善耐藥方面的研究。

綜上所述，耐藥基因在不同菌株、菌種及菌屬之間的傳遞，也造成了細菌耐藥性的播散，我們應對碳青霉烯類耐藥情況密切關注，及時采取有效地控制措施，控制和減少院內交叉感染的發生。