車前草水提物對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫功能的影響

李燕華 梁月琴 李叢元 李翠紅 夏洪穎 李仲昆

昆明市延安醫(yī)院，云南 昆明 650051

車前草(Ribwort plantain)為車前科植物車前或平車前的干燥全草，為世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的藥用植物之一[1-2]。具有涼血、清熱、解毒、利尿、祛痰、抗腫瘤、神經(jīng)和免疫調(diào)節(jié)的作用[3-6]，可治療熱淋澀痛、暑濕瀉痢、水腫尿少、癰腫瘡毒、痰熱咳嗽、吐血衄血等疾癥[7]。免疫系統(tǒng)在抵抗微生物和外來(lái)抗原方面起著重要的作用，它參與了由宿主免疫狀態(tài)所決定的疾病的發(fā)生與恢復(fù)，如癌癥、肥胖、糖尿病、肺結(jié)核等，對(duì)于免疫介導(dǎo)性疾病的預(yù)防和康復(fù)都至關(guān)重要。免疫器官(如骨髓、胸腺、脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)、粘膜免疫系統(tǒng)包括腸黏膜派氏淋巴結(jié)(Peyer′s patches，PPs)、免疫細(xì)胞、免疫分子都是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分[8]。環(huán)磷酰胺(Cyclophosvnamide,CY)是一種烷基化劑，被廣泛應(yīng)用于免疫治療和腫瘤化療，其不良反應(yīng)包括免疫抑制、骨髓抑制、白細(xì)胞減少和氧化應(yīng)激等[9-11]。有報(bào)道[12]稱，CY可產(chǎn)生氧化應(yīng)激，介導(dǎo)氧化還原平衡的破壞，導(dǎo)致生化和生理上的干擾。CY可破壞Th1/Th2平衡[12]，誘導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)下降[13]。目前對(duì)車前草多種藥用價(jià)值的報(bào)道甚多，但對(duì)腸道免疫功能的影響尚未報(bào)道。研究擬通過(guò)觀察小鼠體重變化率、臟器指數(shù)、腸黏膜PPs的數(shù)量及淋巴細(xì)胞表型、細(xì)胞因子水平等指標(biāo)的變化，初步探討PAE對(duì)腸道免疫功能的影響，為開發(fā)利用車前草提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物 車前草購(gòu)自云南新世紀(jì)中藥飲片藥有限公司，經(jīng)云南省楚雄州人民醫(yī)院羅寶生主任藥師鑒定為車前草屬車前草科植物PlantagoasiaticaL。取干燥車前草100 g，煎煮2次，第1次煎煮前先用純水浸泡約20 min，水量為浸過(guò)藥面1～3 cm，先用武火煮沸，再改用文火煎煮30 min。合并2次水煎液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將水煎液濃縮至100 mL，得到車前草水提物，濃度為1 g/mL，含生藥量為1 g/mL，冷藏備用，給藥劑量按生藥量計(jì)算。0.9%氯化鈉注射液(批號(hào)G115051701，四川科倫藥業(yè)股份有限公司)；注射用CY(批號(hào)15102925，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司)。

1.2 動(dòng)物 6～8周齡18～22g的SPF級(jí)ICR雄性小鼠60只，自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)入，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘)2013-0004。飼養(yǎng)于昆明市延安醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，保持室溫25±2℃，濕度50%±5%。

1.3 試劑 改良RPMl-l640培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司)；胎牛血清(FBS，法國(guó)Biowest公司)；抗小鼠CD3e-FITC、抗小鼠CD19-PE購(gòu)自美國(guó)BD-Pharmingen公司；MouseIL-4 ELISA kit、Mouse IFN-Y ELISA kit購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司，其他試劑均為分析純。

1.4 儀器 全自動(dòng)酶標(biāo)儀Model550(美國(guó)BIO-RAD公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(FC-500)(美國(guó)Beckman公司)；LEGENDMICRO17臺(tái)式微量離心機(jī)(美國(guó) Thermo公司)；TD5M低速多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙萬(wàn)佳森儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)；FA2004電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.5 動(dòng)物分組、造模及給藥 60只SPF級(jí)ICR健康雄性小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、PAE低、中、高劑量組，每組12只。PAE低、中、高劑量組分別每天按0.25、0.5、1.0 g/kg灌胃，正常對(duì)照組、模型組給予與PAE體積相當(dāng)?shù)腘S灌胃，共14 d。在實(shí)驗(yàn)第9d開始模型組和PAE各劑量組小鼠隔日給予CY注射液50 mg/kg腹腔注射，共3次，正常組小鼠給予等體積生理鹽水腹腔注射，末次注射CY 24h后頸椎脫臼處死小鼠，取材進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 體質(zhì)量增率、脾臟及胸腺指數(shù)測(cè)定 上述各組小鼠連續(xù)灌胃14 d后稱取體質(zhì)量并頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下分離脾臟和胸腺剔除脂肪和結(jié)締組織后稱重，分別計(jì)算體質(zhì)量增率、脾臟及胸腺指數(shù)：凈體質(zhì)量增率=(處死時(shí)體質(zhì)量-初始體質(zhì)量)/初始體質(zhì)量×100%，臟器指數(shù)(%)=臟器重量(g)/小鼠體質(zhì)量×100%。

1.7 PPs細(xì)胞表型的測(cè)定

1.7.1 PPs計(jì)數(shù) 將腸腔沖洗干凈，迅速放入含5%胎牛血清(5%FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，肉眼可見外腸壁上米白色麥粒樣圓形突起即為派氏結(jié)(PPs)，計(jì)數(shù)PPs個(gè)數(shù)。

1.7.2 PPs細(xì)胞表型測(cè)定 用眼科鑷和眼科剪小心分離出小腸外壁PPs，將PPs迅速浸入RPMI1640液的培養(yǎng)皿中，將PPs移入經(jīng)RPMI1640液浸潤(rùn)過(guò)的120目細(xì)胞篩中，用研磨棒加適當(dāng)力度輕輕研磨，再RPMI1640液沖洗過(guò)濾；取其過(guò)濾液再經(jīng)200目細(xì)胞篩過(guò)濾后收集濾液加至 5 mL，以 2000 r/min 離心 10 min，棄上清液，加入RPMI1640液約 3 mL，重懸細(xì)胞即得PPs細(xì)胞懸液。將收集到的PPs細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×107/mL，分別取100 μL細(xì)胞移入流式細(xì)胞專用管進(jìn)行熒光標(biāo)記，每管依次加入抗小鼠CD3e-FITC，CD19-PE單克隆抗體各0.5 μg，混勻后 4 ℃ 避光 30 min，熒光標(biāo)記結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞2次后重懸于400 μL的PBS中用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型。

1.8 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子分泌水平 打開小鼠腹腔取出全段小腸，向?qū)S3 mL注入腸腔內(nèi)，保留并輕輕晃動(dòng)4 min，使腸內(nèi)容物充分混勻溶解，收集腸腔內(nèi)的NS于EP管中，3000 r/min離心 10 min，取上清液，編號(hào)備用，按酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)鼠IL-4、IFN-γELISA試劑盒說(shuō)明書上的流程操作進(jìn)行檢測(cè)操作，以酶標(biāo)儀測(cè)定腸黏膜IL-4、IFN-γ的光密度值。

2 結(jié)果

2.1 PEA對(duì)免疫抑制小鼠體重增加率、胸腺及脾臟指數(shù)的影響 與正常對(duì)照組相比較，模型組、PEA低、中、高劑量組體重增加率、胸腺指數(shù)均顯著降低(P<0.05)，模型組、PEA低、中劑量組脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比較，PEA中、高劑量組的體重增率顯著增高(P<0.05)，PEA低、中、高劑量組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)；與PEA低劑量組相比較，PEA中、高劑量組體重增率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)；與PEA中劑量組相比較，PEA高劑量組體重增率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠體重、臟器的指數(shù)化情況

2.2 PEA對(duì)PPs數(shù)目及淋巴細(xì)胞表型的測(cè)定 與正常對(duì)照組相比較，模型組、PEA低、中劑量組小鼠腸黏膜PPs數(shù)目及CD19+細(xì)胞比例均顯著降低(P<0.05)，模型組、PEA低劑量組小鼠腸黏膜PPs內(nèi)CD3+細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)；與模型組相比較，PEA低、中、高劑量組小鼠腸黏膜PPs數(shù)目及CD19+細(xì)胞比例均顯著升高(P<0.05)，CD3+細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)；與PEA低劑量組相比較，PEA中、高劑量組小鼠腸黏膜PPs數(shù)目顯著升高(P<0.05)，PEA高劑量組的小鼠腸黏膜CD19+細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)，CD3+細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)；與PEA中劑量組相比較，PEA高劑量組小鼠腸黏膜PPs數(shù)目顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 PEA對(duì)各組小鼠腸黏膜PPs數(shù)目及淋巴細(xì)胞表型的影響

2.3 PEA對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié) 與正常對(duì)照組相比較，模型組、PEA低、中劑量組小鼠腸黏膜IFN-γ、IL-4濃度均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比較，PEA低、中、高劑量組小鼠腸黏膜IFN-γ、IL-4濃度比值均顯著升高(P<0.05)；與PEA低劑量組相比較，PEA中、高劑量組小鼠腸黏膜IFN-γ、IL-4濃度比值均顯著降低(P<0.05)；與PEA中劑量組相比較，PEA高劑量組小鼠腸黏膜IFN-γ、IL-4濃度比值均顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠腸黏膜IFN-γ、IL-4分泌量

3 討論

胸腺是機(jī)體的中樞免疫器官，也是參與細(xì)胞免疫和T細(xì)胞分化、發(fā)育和成熟的重要器官；脾臟是機(jī)體最大的外周淋巴組織器官，是機(jī)體的免疫中心，含有大量NK細(xì)胞、記憶T細(xì)胞及Th細(xì)胞等，在機(jī)體免疫中都發(fā)揮著重要作用。免疫器官所含免疫細(xì)胞數(shù)量及功能與其重量密切相關(guān)，臟器指數(shù)可在一定程度上反應(yīng)機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱，因此，脾臟及胸腺重量的改變可初步反映出受試物對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響[14]。

PPs富含T細(xì)胞(約為40%)和B細(xì)胞(約為60%)，在免疫監(jiān)視和細(xì)胞介導(dǎo)的黏膜免疫中具有重要作用；是誘導(dǎo)細(xì)胞增殖活化和抵御腸道內(nèi)有害物質(zhì)侵襲的主要部位，PPs中淋巴細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和活性狀態(tài)可作為反映腸道黏膜局部的免疫狀態(tài)的指標(biāo)[15]。CD3分子為T細(xì)胞的特有標(biāo)志，表達(dá)于成熟的T淋巴細(xì)胞表面。CD19分子是與B細(xì)胞增殖、分化、活化及抗體產(chǎn)生有關(guān)的重要膜抗原，存在于全體B細(xì)胞表面，是最重要的B細(xì)胞標(biāo)記因子。茯苓多糖能拮抗CY誘導(dǎo)的各淋巴組織中T、B細(xì)胞亞群的失衡，尤其是腸道免疫系統(tǒng)作用[16]，表現(xiàn)為PPs細(xì)胞中CD3+細(xì)胞比例下降，CD19+細(xì)胞比例上升。

維持腸黏膜系統(tǒng)免疫功能平衡的另一個(gè)重要因素是細(xì)胞因子。輔助性T細(xì)胞(helperTcell，Th)可分為Th1和Th2兩種類型，對(duì)機(jī)體免疫有重要的調(diào)節(jié)作用。其中Th1細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，促進(jìn)細(xì)胞毒性活動(dòng)和炎癥反應(yīng)，與遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生和機(jī)體抗腫瘤作用有關(guān)，主要分泌IFN-γ和IL-2等細(xì)胞因子；Th2細(xì)胞輔助B細(xì)胞增殖分化為漿細(xì)胞，分泌抗體調(diào)節(jié)體液免疫，主要分泌IL-4等細(xì)胞因子；IFN-γ和IL-4分別是Th1和Th2細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子。

CY是治療惡性腫瘤最常用的烷化劑，屬?gòu)V譜抗腫瘤藥物，可抑制細(xì)胞的DNA合成、干擾細(xì)胞的增殖、抑制抗體形成，是臨床上治療腫瘤和免疫性疾病的常用藥物之一[8]，其主要毒副作用是免疫和骨髓抑制。在既往的研究[16-18]中提示注射CY可出現(xiàn)免疫抑制，表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重、臟器指數(shù)、腸黏膜PPs的數(shù)量及細(xì)胞因子水平降低，PPs內(nèi)CD3+細(xì)胞比例升高，CD19+細(xì)胞比例均降低，本研究的結(jié)果與之相同。在有的研究中顯示PPs內(nèi)CD3+細(xì)胞數(shù)量降低，由于在本研究并未測(cè)量PPs內(nèi)CD3+、CD19+細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量，CD3+細(xì)胞比例的升高考慮為CD19+細(xì)胞下降較多引起PPs內(nèi)細(xì)胞總數(shù)降低所致。

許多天然物質(zhì)(包括植物來(lái)源和動(dòng)物來(lái)源)具有調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫功能和抗氧化的特性，臨床上已經(jīng)使用許多中草藥來(lái)預(yù)防化療藥物的毒副作用[8，19-20]。有許多生物活性多糖對(duì)免疫系統(tǒng)有較深的影響，且無(wú)明顯毒副作用，具有免疫調(diào)節(jié)功能[21]，如促進(jìn)細(xì)胞因子或趨化因子分泌、激活補(bǔ)體系統(tǒng)和免疫相關(guān)細(xì)胞等[22]。同時(shí)在眾多的研究中，許植物多糖[16，18]能夠?qū)笴Y引起的免疫抑制狀態(tài)如：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重、臟器指數(shù)、腸黏膜PPs的數(shù)量及細(xì)胞因子水平降低，PPs內(nèi)淋巴細(xì)胞表型比例的改變。在本研究中，PEA已表現(xiàn)出了與前述報(bào)道相似的改變，尤其以中、高劑量組明顯，然而中、高劑量之間的差異不明顯。

PAE預(yù)處理可改善CY致免疫抑制小鼠的免疫功能。由于本文僅研究車前草水提物對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠的免疫功能是否有影響及其影響的程度，故并未設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組，有關(guān)車前草水提物與其它免疫調(diào)節(jié)劑的比較，有待進(jìn)一步深入的研究。