不同煎煮時間下10批三果湯散的HPLC指紋圖譜研究

張艷嬌 廖振中 林艾和 李 蓉 黃 寬 范 源,3* 朱培芳

1.云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明 650500；2.云南迪慶藏族自治州藏醫院，云南 迪慶 674499；3.云南中醫藥大學第二附屬醫院，云南 昆明 650216

三果湯散由余甘子(PhyllanthusemblicaLinn.)、訶子(TerminaliachebulaRetz.)和毛訶子[Terminaliabellirica(Gaertn.) Roxb.]三味藥材磨成細粉，按比例為1∶1∶1組成，是藏醫最常見的基礎方，有研究表明[1]三種藥物比例相等時，存在正相互作用，又稱“哲布松湯”，在印度阿育吠陀醫學中應用也較為廣泛。三果湯散具有抗氧化[2]、抗紅細胞增多癥[3]、抗糖尿病[4]的作用；最新研究[6]表明三果湯具有調節腸道微生物[5]、治療口腔疾病如牙周炎、抗微生物感染[7]、影響腫瘤血管生成[8]等作用。其中，酚酸鞣質類成分是三果湯的主要化學成分，較多研究者對其單一成分如沒食子酸(Galiic acid，GA)進行質量控制研究，或者分別測定余甘子、訶子、毛訶子三種藥物中GA的含量[9-11]。李斌等[12]對三果湯中的GA、柯里拉京(Corilagin)、鞣花酸(Ellagic acid，EA)進行含量測定，張海偉等[13]采用HPLC法對不同批次藏藥三果湯中主要酚酸類成分GA、EA進行含量測定。目前相關報道對三果湯散質量控制研究都不全面，測定時因其特征成分不統一，專屬性差，難以實現質量控制標準化[14]。故增加指標性成分檢測及指紋圖譜的建立可更好地為三果湯的質量控制研究提供依據。

傳統中藥的煎劑具有悠久的歷史，現代中醫臨床仍應用廣泛[15]。中藥所含的化學成分會隨煎煮時間不同發生變化，根據疾病的不同，中藥的煎煮時間的確立具有重要意義。指紋圖譜分析是近代藥物尤其是組方中藥用得最普遍的一種質控研究方法，其是評價中藥質量一致性、真實性、產品穩定性的一種可行性模式分析[16]。本實驗采用HPLC法指紋圖譜結合化學模式分析不同煎煮時間下的10批三果湯散的穩定性，以期為三果湯散的質量控制研究及臨床應用提供參考。

1 實驗材料

1.1 儀器 KDM調溫電熱套，常州國華電器有限公司；EYEL4型旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；YL-080ST型超聲清洗機，深圳市語路清洗設備有限公司；FA1004N型萬分之一電子分析天平，上海菁海儀器有限公司；Agilent 1200 系列高效液相色譜儀(VWD紫外檢測器)，美國安捷倫公司。

1.2 試藥及試劑 訶子酸(批號wkq20032707，含量≥98%；購于四川維克奇生物科技有限公司)；訶黎勒酸(批號wkq20042206，含量≥98%；購于四川維克奇生物科技有限公司)；1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖(批號14937-32-7，含量≥98%；購于成都普法瑞科技有限公司)；沒食子酸對照品(批號wkq16081904，含量≥98%；購于四川維克奇生物科技有限公司)；柯里拉京對照品(批號wkq20032604，含量≥98%；購于四川維克奇生物科技有限公司)；鞣花酸對照品(批號MO104AS，含量≥98%；購于美倫生物)；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)，其余試劑均為分析純；10批三果湯散由香格里拉藏醫院制備，詳細情況見表1。

表1 不同批次的三果湯散

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品GA、Corilagin、EA、CHI、CHA、PGG置于容量瓶中，用70%的甲醇溶解并定容至刻度，配置成濃度為0.43、0.32、0.23、0.58、0.23、0.58 mg/mL 的標準品溶液；取以上標準品溶液超聲混勻，過 0.45 μm微孔濾膜，制備混合對照品溶液。

2.1.2 樣品溶液制備 分別取10.0 g不同批次的三果湯散，加入150 mL水，浸泡30 min，于電熱套上回流加熱20、30、40、50 min，過濾，至旋轉蒸發儀上旋干，溫度為75 ℃，加入70%的甲醇 30 mL 溶解樣品，至于50 mL離心管中，超聲 20 min，離心3000 r，離心5 min，取上清液過0.45 μ微孔濾膜，即得40個樣品溶液。

2.1.3 色譜條件 采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動相為磷酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫，檢測波長273 nm，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min。梯度見表2。

表2 洗脫程序

2.2 方法學考察 以樣品S1為測試樣品，按“3.1.2”煎煮30 min，進行精密度、穩定性、重復性實驗，考察該分析方法的可靠性。

2.2.1 精密度實驗 取S1樣品，按“3.1.2”煎煮30 min處理樣品，按“3.1.3”色譜條件連續進樣6次，以4號峰(沒食子酸)為參照峰，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結果14個共有峰的相對保留時間RSD小于0.2%，相對峰面積小于0.7%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復性實驗 取S1樣品，按“3.1.2”煎煮30 min，制備樣品6份，按“3.1.3”色譜條件分別進樣，以4號峰(沒食子酸)為參照峰，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結果14個共有峰的相對保留時間RSD小于0.21%，相對峰面積RSD小于0.55%，表明樣品重復性較好。

2.2.3 穩定性實驗 取S1樣品，按“3.1.2”煎煮30 min制備樣品，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進樣，以4號峰(沒食子酸)為參照峰，結果14個共有峰的相對保留時間RSD小于0.6%，相對峰面積RSD小于0.8%，表明穩定性較好。

2.3 不同煎煮時間下10個批次的三果湯散指紋圖譜結果分析

2.3.1 相似度評價 對不同批次的三果湯散進行指紋圖譜分析，將圖譜以“AIA”的格式導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012A(國家藥典委員會)”軟件，進行數據分析。以N1為參照圖譜，時間窗寬度為0.1 min采用多點校正進行全譜峰匹配。選擇5 min以后、文獻報道較多的主要成分以及分離度較好的峰共14個共有峰。10批三果湯散指紋圖譜匹配，計算相似度。見表3。

表3 不同煎煮時間下10批三果湯散的相似度評價結果

各批次的藥物相似度都在0.9以上，說明該方劑品質均一穩定，差異不大，其中煎煮20、30 min時都以S8的相似度最低，40、50 min時以S7的最低，S1較好。

不同煎煮時間的三果湯對照圖譜及疊加圖譜如圖1所示，其中N1～N10為煎煮20 min，N11～N20為煎煮30 min，N21～N30為煎煮40 min，N31～N40為煎煮50 min；混合對照品如圖2所示，采用對照品指認了6個共有峰，分別是沒食子酸酸(4)、柯里拉京(8)、訶黎勒酸(10)、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖(12)、訶子酸(13)、鞣花酸(14)。

圖1 煎煮20、30、40、50min共有峰指紋圖譜

圖2 A混合標準品色譜圖，B樣品譜圖

2.3.2 聚類分析 將10批三果湯散樣品的14個共有峰峰面積導入Origin2019b中的Cluster analysis中進行分析，CA顯示可將樣品分為四大類，N2、N6、N7、N8、N9、N10、N21、N22、N23、N28、N29、N32、N36、N37、N38、N39、N40共17個樣品為第Ⅰ類，N13、N14、N15、N16、N17、N19、N20共7個樣品為第Ⅱ類，N1、N3、N4、N5、N24、N25、N26、N27、N30、N31、N33、N34、N35共13個樣品為第Ⅲ類，N11、N12、N18共3個樣品為第Ⅳ類；如圖3所示，其中從N1～N40為10批藥材分別煎煮20～50 min，按序排。

圖3 不同煎煮時間下10批樣品的14個峰共有峰聚類圖

2.3.3 主成分分析 以14個共有峰為變量，將40個樣品導入SIMCA-P 14.1 軟件進行主成分(principal components analysis，PCA)分析。由圖可知，得分矩陣圖[R2X(cum)=0.992，Q2(cum)=0.967]，表明該模型預測較好，可將40個樣品區分為4類，該結果與CA一致。如圖4所示。

圖4 不同煎煮時間下的10批樣品的PCA得分圖

2.3.4 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA) 為了進一步檢驗樣本是否有效或者樣本間是否存在差異，找出對組分貢獻較大的變量，將不同煎煮時間下10個批次樣本共有的14個峰面積作為變量，導入SIMCA-P 14.1軟件，采用OPLS-DA分析，觀察樣本聚集情況。其中R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2(cum)分別是0.991、0.358、0.185，表明模型具有較好的預測性和穩定性，且其分類結果與PCA分析結果基本一致。

圖5 不同煎煮時間下10批樣品的OPLS-DA 得分圖

載荷圖(LoadingBi plot，如圖6所示)，峰1、3、4、6、12、14在第三類樣品(N1、N3、N4、N5、N24、N25、N26、N27、N30、N31、N33、N34、N35)等樣品周圍，因此這些峰在第三類樣品中貢獻較大；剩下的峰8個峰與第四類樣品(N11、N12、N18)樣品最接近，因此剩下的8個峰對第四類樣品聚類貢獻較大，而第一類及第二類樣品周圍無共有峰分布，說明這兩組樣品中各組分的含量差異較小。

圖6 不同煎煮時間下10批樣品的OPLS-DA載荷圖

在OPLS-DA模型中，為了篩選出樣品中差異性較大的成分，使用變量權重值(Variableimportanceinprojection，VIP)評價方法，VIP>1.00的變量對組間分類貢獻較大，具有統計學意義[17]。VIP>1.00的峰有5個：3號峰、5號峰、7號峰、10號峰(CHA)、13號峰(CHI)的VIP值分別為1.65、1.57、1.15、1.13、1.09，說明這幾個峰對組間分類貢獻較大。如圖7所示。

圖7 OPLS-DA 的變量權重圖

3 討論

3.1 色譜條件的選擇 本實驗先后考察了乙腈與磷酸水溶液、乙腈醋酸水溶液、甲醇甲酸水溶液的比例，最后選擇了甲醇和0.1%的磷酸水溶液梯度洗脫可使標準品和樣品達到較好的分離效果，酚酸鞣質類化合物在在273 nm時有較強的紫外吸收，因此選擇273 nm作為指紋圖譜的檢測波長。

3.2 模式識別的分析 本實驗建立不同煎煮時間對香格里拉藏醫院的10批三果湯散的指紋圖譜進行分析，顯示樣品都具有較高的相似性，在0.985～1之間。選擇分離度較高，峰面積較大的色譜峰共14個，經對照品指認共有6個成分被分辨出來。不同煎煮時間的10批藥材從直觀結果分析顯示，其樣品含量較單一，藥材質量無明顯差異。CA與PCA分析結果顯示可將不同煎煮時間下的10批三果湯散聚為4類，其分類情況存在一定的差異。并且通過OPLS-DA模型的載荷圖、VIP值分析，判斷14個峰對于樣品分類的具體作用，從而判斷出貢獻最大的峰。

3.3 對不同煎煮時間下10批三果湯中6個化合物的相對峰面積變化的分析 由聚類分析發現，40個樣本中的6個化合物可聚為兩大類，說明GA的含量與其他5個成分差異較大。如圖8所示。

圖8 6個化學成分峰面積聚類分析圖

以4號峰(沒食子酸為對照)，計算6個化合物的相對峰面積，并繪制曲線觀察可知，在煎煮20、30、40、50min時間內，6個化合物的相對峰面積變化如圖9所示：S1～S10中的Corilagin、EA、PGG的趨勢基本一致，相對峰面積的大小也較穩定，CHA在S1～S6、S8、S10中先增后降，以30min達到最大值，其中又以S1和S8中最高，且CHI與CHA在S8中趨勢一致，相對峰面積大小相當；CHI在S1～S7、S9～S10中都呈下降趨勢，以20min達到最大值，其中又以S1、S9中最高。

圖9 不同煎煮時間下10批三果湯散中的6個化合物峰面積變化圖

通過查閱文獻分析可知，三果湯散的組成方藥余甘子、訶子、毛訶子中都含有大量的酚酸鞣質化合物，尤其是如GA、CHI、CHA、PGG、1,3,6-三-O-沒食子酰基葡萄糖等可水解鞣質[18]。水解鞣質在煎煮過程中，加熱的時間可能會使某些化合物分解成GA。本實驗將40個樣品中的6個已知的化合物峰面積進行CA分析發現，GA與其他5個化合物存在較大差異，在所有樣品中的聚集都是最明顯的，因此隨煎煮時間的增加，其他化合物可能會分解合成GA。峰面積折線圖比顯示10批三果湯散中以GA為參照，其他峰的峰面積比都小于1，差異變化較明顯的峰是10號(CHA)與峰13號(CHI)，除CHA外，其他5個化學成分都在20 min最高，綜上可考慮選擇20 min或30 min的煎煮時間為佳，但是不同煎煮時間下各成分的含量變化的相關性還需進一步研究。

目前三果湯指紋圖譜全方位的質控研究報道較少，本實驗建立不同煎煮時間10批三果湯散指紋圖譜并結合化學模式分析的方法，操作便捷、方法穩定，可為三果湯散的質量控制及臨床使用提供參考，但其臨床應用還需后期藥效學實驗進一步研究。