芪蓮益髓清毒顆粒對(duì)低危骨髓增生異常綜合征的療效及其對(duì)TET2和IDH1基因的作用*

王 琰， 李亭亭， 沈明月， 王振振， 鄭 偉， 崔思遠(yuǎn)， 徐瑞榮△

（1山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東省衛(wèi)健委中西醫(yī)結(jié)合血液學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250014；2博興縣中醫(yī)醫(yī)院，山東濱州 256500；3山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西太原 030001）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是一種較為常見的惡性克隆性血液病，一系或多系外周血細(xì)胞減少為其常見臨床特征，且伴有髓系細(xì)胞的發(fā)育異常，具有高度向急性髓系白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)［1］。MDS 多發(fā)于中老年人，目前，支持治療、促造血治療、免疫調(diào)節(jié)、去甲基化藥物及造血干細(xì)胞移植等是MDS 常用的西醫(yī)治療方法，但長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)出現(xiàn)一系列毒副反應(yīng)，如肝腎功損害和骨髓抑制等。由于危險(xiǎn)度分層的不同，MDS 患者的預(yù)后也存在較大的個(gè)體差異，中醫(yī)中藥在MDS 的治療中顯現(xiàn)出其特有的增效減毒的優(yōu)勢(shì)。

研究表明，MDS發(fā)病機(jī)制多樣化，而表觀遺傳學(xué)的DNA 甲基化是其重要的發(fā)生發(fā)展機(jī)制之一，這與抑癌基因的表達(dá)密切相關(guān)，大部分MDS 患者都存在DNA 甲基化。DNA 的高度甲基化導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)沉默，經(jīng)去甲基化治療后，可重新激活其表達(dá)，從而起到抵御疾病的作用。目前，去甲基化藥物是臨床上治療MDS的一種有效方法，取得了一定的療效。甲基胞嘧啶雙加氧酶2（methylcytosine dioxygenase 2，TET2）和異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）是MDS 中較為常見的抑癌基因，主要涉及的機(jī)制是DNA 甲基化的代謝控制。近年來，中藥有效組分對(duì)于惡性腫瘤的治療作用研究較為深入，如半枝蓮和白花蛇舌草等，中醫(yī)中藥在抑制腫瘤細(xì)胞進(jìn)展，改善患者癥狀體征方面都取得了很好療效。芪蓮益髓清毒顆粒是我院血液科根據(jù)我們臨床應(yīng)用近40 年的益氣養(yǎng)陰方化裁而來，具有益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)骨生髓和清熱解毒的功效。芪蓮益髓清毒顆粒治療MDS 療效顯著，部分機(jī)制可能與抑癌基因DNA去甲基化有關(guān)。

本研究我們觀察了芪蓮益髓清毒顆粒對(duì)IPSS-R低危MDS 患者臨床療效的影響，并對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)估，通過檢測(cè)患者治療前后骨髓中TET2和IDH1mRNA 的表達(dá)和DNA 甲基化以探尋其作用機(jī)制，基于液相色譜質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯(lián)用技術(shù)篩選芪蓮益髓清毒顆粒中甲基化相關(guān)化學(xué)成分，為其臨床應(yīng)用提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 臨床資料的收集

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)MDS 診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考《骨髓增生異常綜合征診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)（2014 年版）》［1］，臨床分型標(biāo)準(zhǔn)參照WHO 2016年修訂的臨床分型標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)后評(píng)分參考IPSS-R國(guó)際預(yù)后積分系統(tǒng)。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》［2］，并結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)，辨證屬脾腎兩虛、毒淤阻滯證，癥見頭暈、乏力、心悸、唇甲蒼白、盜汗、腰膝酸軟、發(fā)熱、口渴、便溏、夜尿多。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）年齡18～70 歲；（2）符合MDS診斷標(biāo)準(zhǔn)及臨床分型標(biāo)準(zhǔn)；（3）符合MDS中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，辨證屬脾腎兩虛、毒瘀阻滯證的患者；（4）本研究納入患者均為低危（包括極低危）患者，骨髓原始細(xì)胞均＜5%，IPSS-R 評(píng)分≤3 分；（5）自愿參加本項(xiàng)目研究，并簽署知情同意書者。

1.3 排除及剔除標(biāo)準(zhǔn) （1）精神疾病患者；（2）接受去甲基化治療患者；（3）孕期及哺乳期婦女；（4）合并其他惡性腫瘤或血液病者；（5）合并嚴(yán)重出血、感染、心肝腎功能不全者。

1.4 一般資料 選取2018 年01 月～2019 年10 月就診于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院血液病科的IPSS-R低危MDS 患者作為研究對(duì)象，共60 例，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組和對(duì)照組，各30 例。兩組患者的性別、年齡和病程等臨床資料經(jīng)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。另取10 例造血干細(xì)胞供者作為正常對(duì)照組，其中男性7 例，女性3 例。本研究通過了山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料比較Table 1. Comparison of the baseline characteristics between the two groups（n=30）

2 方法

2.1 分組和藥物治療 對(duì)照組：給予最佳的支持治療［3］，即根據(jù)患者病情給予必要的基礎(chǔ)支持治療，包括輸血治療和細(xì)胞因子治療等。觀察組：在對(duì)照組的基礎(chǔ)上，給予我院院內(nèi)制劑芪蓮益髓清毒顆粒（魯藥制字Z20130002，專利號(hào)ZL201310227800.2）治療。芪蓮益髓清毒顆粒藥物組成：黃芪、地黃、半枝蓮、太子參、黃精、天冬、白術(shù)、白花蛇舌草、女貞子、旱蓮草、麥冬、蒲公英、小薊、茯苓、甘草；服用方法：每袋3 g，每次3 袋，每日3 次。上述方案共治療6 個(gè)月后觀察療效。

2.2 療效評(píng)價(jià) 中醫(yī)證候積分標(biāo)準(zhǔn)［2］：對(duì)MDS 的癥狀進(jìn)行分級(jí)量化評(píng)價(jià)，沒有感覺，計(jì)0 分；稍有感覺，計(jì)1分；感覺較重，但可耐受，計(jì)2分；感覺嚴(yán)重，不可耐受，計(jì)3分。西醫(yī)療效標(biāo)準(zhǔn)：采用2006修訂的MDS國(guó)際工作組療效標(biāo)準(zhǔn)，將完全緩解（complete respanse，CR），部分緩解（partial responese，PR），血液學(xué)改善（hematological improvement，HI）計(jì)入總有效率；將疾病穩(wěn)定（disease stability，SD）和疾病進(jìn)展（disease progression，PD）視為治療無效。

2.3TET2和IDH1mRNA的表達(dá)檢測(cè) 抽取各組患者骨髓標(biāo)本3 mL，EDTA 抗凝，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)柟荆┨荻入x心分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用RNA/DNA 提取試劑盒（青島浩賽公司）抽提RNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（Roche LightCycler 480 PCR儀）檢測(cè)TET2和IDH1mRNA 的表達(dá)。反應(yīng)條件：95 ℃3 min；95 ℃10 s，60 ℃15 s，45 個(gè)循環(huán)。引物序列見表2。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2. Primer sequences for RT-qPCR

2.4TET2和IDH1基因甲基化檢測(cè) 骨髓標(biāo)本處理同上，收集細(xì)胞提取DNA。甲基化特異性PCR 法（MS-PCR）檢測(cè)TET2和IDH1基因甲基化。DNA 重亞硫酸鹽修飾及純化（試劑盒購(gòu)自北京天根）：熱循環(huán)條件為95 ℃10 min，64 ℃60 min，4 ℃保持；按說明書步驟收集純化后的DNA 溶液，進(jìn)行甲基化特異性PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件為95 ℃5 min；94 ℃20 s，52 ℃30 s，72 ℃20 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。將產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析：制備凝膠，在第1 個(gè)膠孔內(nèi)加入5 μL 的DNA Maker，其 他 膠 孔 內(nèi) 加 入10 μL 混 有DNA 加樣緩沖液的MSP 產(chǎn)物，電壓120 V，運(yùn)行時(shí)間30 min；取出膠塊在凝膠成像儀（上海天能科技有限公司，Tanon 1600）上觀察拍照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：甲基化陽性：只有甲基化引物擴(kuò)增條帶，或同時(shí)表達(dá)甲基化、非甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物條帶；甲基化陰性：只有非甲基化引物擴(kuò)增條帶。甲基化引物序列見表3。

表3 MS-PCR引物序列Table 3. Primer sequences for MS-PCR

2.5 基于LC-MS 技術(shù)的芪蓮益髓清毒顆粒物質(zhì)基礎(chǔ)檢測(cè) 芪蓮益髓清毒顆粒原方中草藥400 g（購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥研究中心）機(jī)械粉碎，加入8 倍水浸泡30 min，煎煮40 min，再加入3 200 mL 水，煎煮40 min，合并濾液后低溫旋蒸儀加壓濃縮至1 600 mL，相對(duì)密度1.23，按照《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑》中湯藥濃度的標(biāo)化計(jì)算，濃度為2.5 g/mL。罐裝于250 mL 輸液瓶中，滅菌后用0.22 μm 的過濾器除菌，取3 mL 作為送測(cè)樣本，分為3 個(gè)組。液相色譜-質(zhì)譜分析儀器為WatersTMNexera UPLC 超高效液相串聯(lián)QE 高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，數(shù)據(jù)采集結(jié)果使用The Human Metabolome Database（HMDB）和Lipidmaps（v2.3）以及METLIN 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，計(jì)數(shù)資料分析采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料分析采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組患者癥狀平均積分比較

治療前觀察組與對(duì)照組相比無顯著性差異。治療后觀察組和對(duì)照組較治療前積分均顯著降低（P＜0.01），觀察組與對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.05），見表4。

表4 兩組患者癥狀平均積分比較Table 4. Comparison of average symptom scores between the two groups（Meas±SD. n=30）

2 兩組患者臨床療效比較

觀察組30例病例中總有效率為63.33%，對(duì)照組總有效率為46.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表5 兩組患者臨床療效比較Table 5. Comparison of clinical efficacy between the two groups（n=30）

3 TET2和IDH1 mRNA的表達(dá)水平比較

觀察組和對(duì)照組治療前TET2和IDH1的mRNA表達(dá)水平均較正常對(duì)照組降低，經(jīng)單因素方差分析，有顯著性差異（P＜0.05）；觀察組和對(duì)照組治療后的TET2mRNA 表達(dá)水平顯著高于治療前（P＜0.01），仍較正常對(duì)照組降低（P＜0.05）。觀察組和對(duì)照組治療后的IDH1mRNA 表達(dá)水平顯著較治療前無顯著差異；治療后觀察組IDH1mRNA 表達(dá)水平高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、2。

Figure 1. Comparison of TET2 mRNA expression levels. Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control group；△△P＜0.01 vs before.圖1 TET2的mRNA表達(dá)水平比較

Figure 2. Comparison of IDH1 mRNA expression levels. Mean±SD.**P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.05 vs before.圖2 IDH1的mRNA表達(dá)水平比較

4 TET2和IDH1基因DNA甲基化情況比較

如表6 所示，30 例觀察組MDS 患者治療前有9例出現(xiàn)TET2基因DNA 甲基化陽性，治療后有2 例出現(xiàn)TET2基因DNA 甲基化陽性，有7 例患者TET2基因DNA甲基化轉(zhuǎn)為陰性，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，治療前后有顯著差異（P＜0.05）。30例觀察組MDS患者治療前有5例出現(xiàn)IDH1基因DNA 甲基化陽性，治療后有2 例患者IDH1基因DNA 甲基化陽性，有3 例患者IDH1基因DNA 甲基化轉(zhuǎn)為陰性，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，治療前后無顯著性差異（P＞0.05）。對(duì)照組治療前后TET2和IDH1基因DNA 甲基化陽性率無改變。TET2和IDH1甲基化檢測(cè)電泳圖見圖3。

表6 TET2和IDH1 DNA甲基化情況比較Table 6. Comparison of DNA methylation of TET2 and IDH1

Figure 3. Methylation of TET2 and IDH1. A：methylation of TET2；B：methylation of IDH1. u：product bands amplified by unmethylated primers； m： product bands amplified by methylation primers.圖3 TET2和IDH1 DNA甲基化情況

討 論

5 芪蓮益髓清毒顆?；衔镏写x物成分定性分析

通過LC-MS 檢測(cè)，在芪蓮益髓清毒顆粒樣本中共篩選出3 336個(gè)代謝物，根據(jù)數(shù)據(jù)矩陣中代謝物信息定性分析，從中篩選出與DNA 甲基化相關(guān)的21 個(gè)化合物，見表7。

表7 通過高效液相色譜-電離/質(zhì)譜法從芪蓮益髓清毒顆粒中鑒定出21個(gè)化學(xué)成分Table 7. Twenty-one chemical constituents were identified from Qilian-Yisui-Qingdu granule by HPLC-i/MS

6 差異代謝物網(wǎng)絡(luò)通路分析

本研究利用代謝物的KEGG ID 進(jìn)行通路富集分析，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)代謝物參與的主要代謝途徑與信號(hào)通路進(jìn)行挖掘，顯著性富集的KEGG Pathway 見圖4，代謝物主要富集于癌癥的中心碳代謝、氨基酸生物合成、蛋白質(zhì)消化吸收、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸生物合成、檸檬酸循環(huán)、胰高血糖素信號(hào)通路、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、HIF-1 信號(hào)通路、精氨酸和脯氨酸代謝等。

Figure 4. Enrichment pathway of differential metabolites in Qilian-Yisui-Qingdu granule. A：histogram，P value of metabolic pathway is the significant enrichment of this metabolic pathway；B：bubble chart，ordinate is the name of metabolic pathway，abscissa is enrichment factor（the larger the enrichment factor is，the greater the enrichment degree is）；the color from red to green indicates that the P value decreases in turn（the larger the dot is，the more metabolites are accumulated in the pathway）.圖4 芪蓮益髓清毒顆粒樣本差異代謝物富集通路

在疾病治療過程中，中醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)辨證論治，即根據(jù)患者的癥狀和體征采用聯(lián)合治療策略來治療疾病。中藥復(fù)方由多種中藥組成，多種成分可以作用于多個(gè)靶標(biāo)并發(fā)揮協(xié)同治療作用［4］。本項(xiàng)研究中，我們重點(diǎn)觀察了芪蓮益髓清毒顆粒對(duì)MDS 的療效，以及它對(duì)DNA甲基化的影響。

隨著高通量基因芯片技術(shù)的大量研究表明［5］，DNA 甲基化是MDS 發(fā)生與發(fā)展過程中常見且最為重要的修飾方式之一，并對(duì)其治療和預(yù)后有重要意義?；虮磉_(dá)的表觀遺傳調(diào)控多發(fā)生在DNA、組蛋白和RNA 水平，很多人類血液腫瘤疾病的病理基因表達(dá)與異常的表觀遺傳甲基化修飾有關(guān)［6-7］。DNA高度甲基化可表現(xiàn)為多種基因發(fā)生突變，其中以抑癌基因TET和IDH等的突變最為重要，這些抑癌基因的沉默與其啟動(dòng)子區(qū)（CPG）的高甲基化有關(guān)，從而導(dǎo)致了MDS 的發(fā)生發(fā)展［8-9］。賴氨酸或精氨酸殘基在組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（histone methyltransferase，HMT）的催化下，會(huì)導(dǎo)致甲基化的發(fā)生。組蛋白去甲基酶為黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）依賴的氧化酶，可分為賴氨酸特異性去甲基酶（lysine specific demethylase，LSD）家族和含有jumonji 結(jié) 構(gòu) 域（jumonji domain-containing protein，Jmjc）的家族蛋白。Jmjc家族去甲基酶使用α酮戊二酸酯（α-ketoglutarate，αKG）作為酶激活的輔助因子，其中催化輔助因子FAD 和αKG 由三羧酸代謝途徑生成。同樣，DNA 去甲基化酶TET 家族蛋白的激活也需要FAD 和αKG。因此，線粒體中的三羧酸代謝途徑可以直接參與基因組的表觀遺傳調(diào)控。

TET基因包括3種，分別是TET1、TET2和TET3。研究顯示［10-12］，TET2突變常見于多種惡性血液病，如MDS、急 性 髓 性 白 血 ?。╝cute myeloid leukemia，AML）和慢性粒單核細(xì)胞白血病（chronic myelomonocytic leukemia，CMML）等，其突變率約在19%～23%之間。TET2基因突變可導(dǎo)致DNA 發(fā)生高度甲基化，其發(fā)生機(jī)理是TET2基因突變使其正常生理功能喪失，從而使5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）的生成量減少。TET2作為一種抑癌基因，可促進(jìn)DNA 去甲基化，在DNA 甲基化和表觀遺傳學(xué)方面調(diào)控基因表達(dá)，在血液腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。TET2基因突變會(huì)促進(jìn)其啟動(dòng)子區(qū)甲基化，DNA 發(fā)生高度甲基化則促使疾病發(fā)生。但對(duì)于TET2基因突變對(duì)MDS 患者的預(yù)后影響仍存在爭(zhēng)議。Kosmider 等［13］報(bào)道，TET2突變是MDS 中有利的預(yù)后因素，無TET2突變的患者死亡率上升，預(yù)后較差。Jiang 等［14］運(yùn)用二代測(cè)序法對(duì)159 例MDS患者15 個(gè)MDS 相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，顯示TET2變異等位基因頻率較高（＞18%）的患者與變異較低的患者以及沒有TET2突變的患者相比總生存率明顯縮短。同時(shí)，有研究對(duì)90 例MDS 患者進(jìn)行TET2基因突變檢測(cè)，結(jié)果表明患者生存率在不同基因型之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［15］。Lee 等［16］觀察到伴有TET2突變的MDS 經(jīng)8 周期去甲基化治療，三年后轉(zhuǎn)化為急性髓系白血病概率降低。

IDH 是在細(xì)胞能量代謝中起著重要作用的三羧酸循環(huán)限速酶，參與細(xì)胞的氧化還原及代謝、DNA 的損傷修復(fù)等重要活動(dòng)，包括IDH1、IDH2和IDH3。代謝酶的突變使細(xì)胞發(fā)生惡性變，最終影響DNA 和組蛋白的表觀遺傳學(xué)調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）依賴的異檸檬酸脫氫酶（IDH1 和IDH2）、琥 珀 酸 脫 氫 酶（succinate dehydrogenase，SDH）和延胡索酸水合酶（fumarate hydratase，F(xiàn)H）突變頻繁。這些代謝酶的失活突變導(dǎo)致2-羥基戊二酸鹽、琥珀酸鹽和富馬酸鹽分別堆積。琥珀酸和富馬酸都抑制TET 和Jmjc 家族蛋白的酶活性。攜帶IDH1/IDH2突變的癌細(xì)胞表現(xiàn)出DNA 和組蛋白的高甲基化，在膠質(zhì)瘤和惡性血液病中常見。有研究表明［17］，IDH基因突變（主要為IDH1的突變）是影響MDS DNA 甲基化的重要基因之一，盡管其在MDS 患者中檢出率較低。王燕梅［18］在對(duì)15 例MDS 患者基因檢測(cè)中未觀察到IDH1突變，在復(fù)發(fā)難治性白血病患者中發(fā)現(xiàn)IDH1突變率較高且與預(yù)后不良相關(guān)。Wang［19］等通過基因組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)97 例MDS 患者骨髓標(biāo)本發(fā)現(xiàn)其突變率為7.2%，在難治性貧血患者中突變率較高（16.6%），與較高的骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)和較低中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)，提示預(yù)后不良。

本研究結(jié)果顯示，IPSS-R低危MDS患者TET2和IDH1mRNA 表達(dá)較正常人顯著減少，芪蓮益髓清毒顆?？梢陨险{(diào)TET2和IDH1mRNA的表達(dá)。TET2和IDH1作為抑癌基因，通過促進(jìn)DNA 去甲基化發(fā)揮其抑癌作用。當(dāng)TET2和IDH1表達(dá)下調(diào)時(shí)，DNA 去甲基化作用減弱，DNA 異常的高甲基化導(dǎo)致了MDS 的發(fā)生與發(fā)展。本研究對(duì)觀察組IPSS-R 低危MDS 患者治療前后的骨髓單個(gè)核細(xì)胞的TET2和IDH1DNA甲基化進(jìn)行了檢測(cè)，經(jīng)過芪蓮益髓清毒顆粒治療后，TET2甲基化陽性率由30%下降為6.7%，IDH1甲基化陽性率由16.7%下降為6.7%；而對(duì)照組甲基化陽性率沒有發(fā)生改變。此結(jié)果與觀察組治療前后TET2和IDH1mRNA 的表達(dá)情況相吻合，提示DNA去甲基化可能是其作用機(jī)制之一。此外，本研究TET2甲基化陽性率、IDH1甲基化陽性率接近或略高于報(bào)道的突變率［14-15，19］，前面提到，TET2和IDH1的高突變會(huì)使細(xì)胞過度甲基化，另一方面，DNA 甲基化亦往往會(huì)導(dǎo)致該堿基突變率的增加，這是表觀遺傳變異影響遺傳變異的一個(gè)重要方面，可見，DNA 甲基化與基因突變關(guān)系較為密切，相互影響，但由于發(fā)病機(jī)制不同，二者雖有關(guān)聯(lián)但不能等同。芪蓮益髓清毒顆粒由益氣養(yǎng)陰方化裁而來，功效益髓補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱解毒止血，適用于由氣虛、陰虛、骨髓衰竭、熱毒內(nèi)伏、暗耗陰血等引起的頭暈、乏力、倦怠、心悸、衄血等癥狀的骨髓異常增生綜合征患者。方中太子參益氣生津，入肺、脾二經(jīng)；熟地黃滋補(bǔ)腎陰，補(bǔ)益精髓，歸肝、腎經(jīng)，二者合用使氣旺精生，共為君藥。黃芪助太子參益衛(wèi)固表；黃精益氣養(yǎng)陰，入脾腎二經(jīng)；半枝蓮、白花蛇舌草清熱解毒；女貞子、旱蓮草既可滋肝補(bǔ)腎，又可清熱止血，共為臣藥。佐以天冬、麥冬，補(bǔ)益肺胃之陰，肺陰足則能生腎水；蒲公英佐助白花蛇舌草、半枝蓮增強(qiáng)清熱解毒、消腫散結(jié)之效；小薊涼血止血，與補(bǔ)氣藥合用則止血而不留瘀；茯苓、白術(shù)健脾利濕、顧護(hù)脾胃，既可防君藥的滋膩之性損傷脾胃的同時(shí)可佐制清熱藥的苦寒之性；甘草調(diào)和諸藥，為佐使藥。諸藥配伍，共奏益腎填髓解毒之效。我們前期研究觀察到，益氣養(yǎng)陰方通過作用于線粒體凋亡因子細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）、凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF），有絲分裂蛋白、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）啟動(dòng)子區(qū)甲基化等作用機(jī)制促進(jìn)小鼠白血病細(xì)胞凋亡［20-22］。且芪蓮益髓清毒顆粒聯(lián)合傳統(tǒng)化療在急性白血病的治療中有增效減毒的作用［23］?，F(xiàn)代藥理研究顯示，女貞子含藥血清在一定程度上有逆轉(zhuǎn)p16基因高甲基化的作用［24］。研究證實(shí)［23-27］，半枝蓮和白花蛇舌草可以抗腫瘤，其含有的野黃芩苷、野黃芩素和槲皮素等黃酮類活性物質(zhì)是其抗腫瘤作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，抑制腫瘤干細(xì)胞在體內(nèi)外的分化是其機(jī)制之一。觀察組在改善中醫(yī)證候積分方面優(yōu)于對(duì)照組，且不良反應(yīng)發(fā)生率低于對(duì)照組，其能更好的改善氣短、頭暈乏力和納呆等中醫(yī)癥狀，可能與芪蓮益髓清毒顆粒中黃芪、太子參等補(bǔ)氣扶正藥物作用相關(guān)，并進(jìn)一步驗(yàn)證了其增效減毒作用。

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是目前常用的代謝組學(xué)技術(shù)，結(jié)合代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件可對(duì)質(zhì)譜信息進(jìn)行解析，在單次分析中可檢測(cè)和鑒定幾百至幾千種中藥代謝物。近年來，LC-MS 成為分析中藥復(fù)方中草藥成分化合物的必不可少的工具。我們通過LCMS 法從芪蓮益髓清毒顆粒提取物中鑒定出與DNA甲基化相關(guān)的21種代謝物，并通過KEGG pathway 富集分析顯示，篩選出的代謝物作用靶點(diǎn)主要作用于三羧酸循環(huán)、癌癥的中心碳代謝、丙氨酸代謝、天冬氨酸代謝、谷氨酸代謝、低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）代謝、胰高血糖素信號(hào)通路等。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、胰島素、胰島素分泌通路都可以直接參與糖脂代謝的高甲基化［28］。谷氨酸和乳酸都是丁酸鹽的前體，能夠通過DNA 甲基化改變結(jié)腸粘膜組織中的基因表達(dá)［29］；精胺可以逆轉(zhuǎn)鳥氨酸脫羧酶抑制引起的變化，脫羧S-腺苷甲硫氨酸增加，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶活性降低，異常DNA甲基化增加［30］；L-精氨酸可以通過調(diào)節(jié)IL-10 啟動(dòng)子DNA 甲基化來調(diào)節(jié)新生兒調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory cells，Tregs）［31］；延胡索酸可以作為細(xì)胞滲透制劑代謝物，影響CD4 T 細(xì)胞表觀全基因組DNA 甲基化變化［32］；抗壞血酸和L-脯氨酸，影響著胚胎干細(xì)胞的DNA 甲基化、轉(zhuǎn)錄譜和能量代謝［33］；膽堿作為蛋氨酸循環(huán)營(yíng)養(yǎng)素可以提供DNA 甲基化反應(yīng)的甲基基團(tuán)，直接改變基因的表觀遺傳調(diào)控［34］；丙酮酸鹽能夠通過DNA 甲基化至少部分參與組蛋白去乙?；?，抑制宮頸癌細(xì)胞的發(fā)展［35］。這些化合物的檢出，為芪蓮益髓清毒顆粒治療MDS提供了靶向依據(jù)。

近年來，開發(fā)治療癌癥藥物的進(jìn)展主要集中在阻止癌細(xì)胞有效代謝途徑的抑制劑上，針對(duì)某些關(guān)鍵代謝酶活性的抑制劑具有很大的研究潛力。一些與癌細(xì)胞存活和進(jìn)展有關(guān)的代謝途徑如線粒體代謝、DNA 甲基化代謝、糖酵解和自噬等為靶點(diǎn)，為新藥物的開發(fā)提供了有效策略。我們研究結(jié)果顯示，芪蓮益髓清毒顆粒的有效組分功能有助于與多個(gè)目標(biāo)相互作用，并在治療MDS 甲基化過程中發(fā)揮協(xié)同作用，有助于提高M(jìn)DS的治療效果。綜上，芪蓮益髓清毒顆粒治療MDS 是有效的，可以作為MDS 治療的一種可選的補(bǔ)充療法。