經顱電刺激在嚙齒動物中的研究進展*

宋美慧， 王玉梅， 周 正， 褚光輝， 付 玉

（昆明理工大學醫學院，云南昆明 650000）

經顱電刺激（transcranial electrical stimulation，tES）是一種通過在頭皮上施加微弱電流來改變大腦功能的神經調節工具。該方法在上世紀80 年代被提出，隨著社會老齡化和神經系統疾病發病率的日益增長，該方法由于其無創、副作用小、成本低、易操作等優勢，近年來逐漸受到重視［1］。目前tES 已應用于改善認知功能和運動功能障礙，以及治療包括阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）和帕金森病（Parkinson disease，PD）在內的神經退行性疾病。

tES 的裝置因簡單，主要包括刺激儀和電極。tES 依據刺激電流主要分為經顱直流電流刺激（transcranial direct current stimulation，tDCS）和經顱交流電流刺激（transcranial alternating current stimulation，tACS）兩種，依據刺激電極極性tDCS 又分為陽極tDCS（anodal tDCS，atDCS）和 陰 極tDCS（cathodal tDCS，ctDCS）。tACS 則主要提供特定頻率的正弦交流電刺激，偽刺激在tDCS 和tACS 中作為對照使用。刺激電極的選材也十分簡單，如生理鹽水浸泡的海綿、導電凝膠等，不僅可以減少刺激部位與電極接觸的不良反應，還可以避免如tDCS 中的電極極化等問題。此外，根據刺激方案不同，tES 刺激電極可置于頭皮的任一位置，其對電極在嚙齒動物中通常置于胸腹部（圖1A）。刺激狀態通常可分為自由活動狀態和束縛狀態（圖1B）。

Figure 1. Schematic diagram of tES in rodents. A：the set-up of tES in rodents；B：tES for freely moving rodents（left）and restrained rodents（right）. During freely moving state，animals can move freely in an experimental apparatus，such as in a cage. tES includes two electrodes：active electrode and counter electrode. The active electrode is positioned over the skull，and the counter electrode is usually applied over the ventral thorax. The active electrode consists of a plastic tube filling with saline solution just prior to stimulation. The counter electrode can be an adhesive conductive gel，and can be fixed by a custom corset to ensure its stability. The wires from the counter electrode to the tES stimulator can also be fixed in the corset. The size of the active electrode is specified by the diameter of the tube，and that of the counter electrode is specified by the size of the conductive gel（refer to“A fixation device for nerve stimulation in mice"，patent No. 201921895884.6）. There is no custom corset for the restrained animals during tES，and the counter electrode can be directly connected to the stimulator.Animals are placed in a plastic container with their heads and the above active electrodes outside，and with their noses and mouths located in a curved semicircle ring for avoiding moving. The plastic container can be fixed by several rubber bands during tES（refer to“A fixation device in mice"，patent No. 201710120994.4）.圖1 嚙齒動物tES示意圖

在生物醫學研究領域中，嚙齒動物模型是最常用、最有利的工具之一。嚙齒動物具有遺傳背景清晰、方便飼養和繁殖等優勢，尤其在制備各種疾病或某種癥狀的模型方面較為理想，如早衰小鼠模型、AD 小鼠模型等。在嚙齒動物中進行tES研究具有很多優勢，不僅便于操作，還可以精確地了解神經元所承受的電流強度和方向，尤其是對于一些非常規且風險較高的刺激方案［2］。簡言之，嚙齒動物模型為探索tES增強腦功能的研究提供了諸多便利，已成為臨床應用前的“試驗場”。本文總結了近年來tES 在嚙齒動物上的研究進展，重點闡述了其作用效果以及相關機制。

1 tES的功能研究

目前，tES 的功能研究中，tDCS 一直備受關注。tDCS 在嚙齒動物模型中主要用于緩解神經系統疾病，還可用于改善認知功能，增強運動能力。而tACS的功能研究在嚙齒動物上幾乎沒有。臨床研究報道tACS 可以調節聽力、運動、認知和記憶功能等，而嚙齒動物研究則側重于闡述tACS可能的作用機制。

1.1 tDCS 在神經系統疾病中的作用 tDCS 在AD、PD、中風、抑郁、癲癇、譫妄等多種類型的神經系統疾病模型中對其病理癥狀均有緩解作用。（1）就AD 而言，tDCS 可以改善AD 大鼠和小鼠的認知功能［3-4］，單次和重復多次的tDCS 均可改善其空間學習和記憶能力，并且這種改善作用可維持長達2個月［5］。（2）就PD 而言，tDCS 可暫時改善PD 嚙齒動物模型的運動行為［6-7］，增加PD 小鼠多巴胺含量，通過調節自噬來緩解1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）引起的PD癥狀［8］，并且具有神經保護作用［9］。（3）tDCS還可緩解中風。有研究表明ctDCS 在中風的急性期發揮神經保護作用［10］。tDCS調節小鼠的神經發生并激活小膠質細胞，表明tDCS 可促進中風后功能的恢復［11］。（4）tDCS 還具有顯著的抗抑郁作用［12］。tDCS 具有持久（3 周）的抗抑郁作用，同時不會影響動物的運動功能，也不會使動物產生焦慮樣行為，但其作用效果依賴于刺激參數的設置［13-15］。有研究者認為tDCS 有望成為重度抑郁癥的一種極其有效的干預措施［16］。（5）tDCS 還具有抗癲癇作用。tDCS 能有效治療癲癇發作，并且可以對癲癇的發作產生短期和長期抑制作用；同時確定100 μA 是癲癇發作和其他行為障礙的tDCS 使用最低閾值［17］。（6）tDCS 還能夠使嚙齒動物從譫妄中快速恢復，特別在右側額葉區域中tDCS 的應用受到越來越多研究者的關注，表明它可能具有預防或快速治療譫妄的潛力［18］。相關文獻的數據總結見表1。

表1 tDCS在嚙齒動物神經系統疾病中的作用Table 1. Effect of tDCS on nervous system diseases in rodents

1.2 tDCS 對認知功能的作用 （1）tDCS 可改善小鼠的認知功能。有研究表明，重復多次的atDCS 可以改善空間記憶和工作記憶，而不影響運動和焦慮等行為，并且tDCS 對小鼠工作記憶的改善在4 周后仍然存在［22］。還有研究發現，tDCS除了可以逆轉AD轉基因小鼠的認知障礙，還可以改善正常小鼠的認知能力［3］。atDCS 在AD 的早期也可改善空間學習和記憶，減輕Aβ 沉積并對神經元具有保護作用［19］。此外，atDCS可增加小鼠腦中微血管流動和組織的氧合指數，這有助于改善神經系統的認知功能［23］。（2）tDCS也能改善大鼠的認知功能［5］。tDCS可以提高大鼠的記憶能力，有效緩解其認知障礙［19］。已有研究證明atDCS 對大鼠空間記憶的提高具有長期效果［24］。對于AD 大鼠進行單次和重復多次的tDCS 不僅能改善空間學習和記憶［4］，而且具有明顯的神經保護作用［5］。此外，Leffa 等［25］也證明tDCS 能有效治療大鼠顱腦外傷后的注意力障礙。相關文獻的數據總結見表2。

表2 tDCS對嚙齒動物認知功能的作用Table 2. Effect of tDCS on cognitive function of rodents

1.3 tDCS 對運動功能的作用 tDCS 對運動功能的影響在臨床上研究較多，在嚙齒動物上研究較少。嚙齒動物上的研究主要偏向于tDCS 影響運動功能的機制，如對皮層興奮性的影響，相關腦區主要為運動皮層，如初級運動皮層（primary motor cortex，M1）和次級運動皮層（secondary motor cortex，M2）。M1區與運動執行、運動技巧記憶的形成和鞏固相關。研究發現，atDCS能夠增強大小鼠運動皮層的運動誘發電位，而ctDCS 則具有抑制作用［27］，表明tDCS 可以影響運動神經系統的功能。其次，tDCS 能夠影響大鼠運動皮層的神經元單位放電［28］、誘發場電位［29］，以及運動皮層之間的神經傳導［30］。而在小鼠上的研究發現，tDCS 能夠增強M1 區BDNF 依賴的突觸可塑性，提示tDCS 在提高運功技能學習中具有潛在作用［9，31］。再次，在PD 模型上的研究顯示，tDCS 應用于大小鼠的M1區均具有潛在的神經保護作用，并促進 肢 體 運 動 等［10，21，28］。相 關 文 獻 的 數 據 總 結見表3。

表3 tDCS對嚙齒動物運動功能的作用Table 3. Effect of tDCS on motor function of rodents

1.4 tDCS 對其他功能的作用 tDCS 在其他功能上的研究主要是在大鼠上，在改善視覺功能和調節腦血流量方面均有報道。有研究表明，tDCS 可改善弱視大鼠的視覺能力［34］，重復多次的atDCS 提高了弱視大鼠的視覺敏感度，有效恢復弱視動物的視覺功能。還有研究發現tDCS 可調節局部腦血流量，對大鼠給予atDCS，30 min后其腦血流量增加，ctDCS則降低腦血流量，因此表明tDCS 通過電極極性依賴的方式調節腦血流量［35］。此外，ctDCS在動物實驗中亦可引起長達90 min 的可逆性局部腦血流量的減少，并且腦血流量減少的區域并不局限于刺激的部位［36］。相關文獻的數據總結見表4。

表4 tDCS對嚙齒動物其他功能的作用Table 4. Effect of tDCS on other functions of rodents

2 tES的機制研究

tES 因其潛在的治療價值而受到關注，因此近年來對其機制的研究也逐漸增加。tDCS的機制研究較多，主要體現在對神經元興奮性、突觸可塑性與Ca2+濃度的影響等方面；tACS的機制研究較少，主要涉及調節腦節律，并影響興奮/抑制平衡等方面。

2.1 tDCS 對神經元興奮性的影響 tDCS 對神經元興奮性的具有調節作用［32，39］。根據陽極或陰極刺激，tDCS分別增加或降低皮質興奮性，這取決于電流的極性。由于不同極性直流電所引起的靜息膜電位變化不同，從而引起神經元的放電速率增加或降低。atDCS 導致神經元的去極化引起興奮性作用，而在ctDCS則引起超極化抑制皮層神經元活動［32］，進而影響動物的認知和行為表現［40］。tDCS 對動物的額葉、海馬、運動皮層、視皮層等腦區的神經元興奮性均可產生顯著影響，并在這些皮層中產生持久的刺激后效應［37-38，41-43］。

tDCS對神經元興奮性的影響與腦內中樞神經遞質興奮/抑制平衡調節有關。tDCS 可以調節腦內谷氨酸能、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）能和多巴胺能系統的活動[44]。tDCS 能夠增強大鼠腦內的GABA 抑制作用，引起GABA 濃度的降低，并且這些變化與大鼠的運動學習、運動記憶過程高度相關[45]。此外，atDCS 能夠增強PD 大鼠中多巴胺能神經細胞移植的存活和整合[7]。

2.2 tDCS 對突觸可塑性的影響 tDCS 能夠改變神經元的突觸可塑性［33，42，46］。tDCS 調節感覺運動皮層［47］和聽覺皮層［48］神經元的突觸可塑性。tDCS可以影響突觸可塑性及長時程增強（long-term potentiation，LTP）的分子決定因素，如腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）。atDCS 增強大鼠的海馬LTP，ctDCS 則具有相反的作用，并且atDCS 對海馬LTP 的影響在刺激結束一周后仍持續存在［49-50］。atDCS 可以通過調控BDNF 的表達來增強嚙齒動物的皮層神經元突觸可塑性，進而提高動物的記憶能力［13］。atDCS 可以促進運動皮層的神經元活動，增加BDNF 的分泌，影響運動皮層神經元的突觸可塑性，提示BDNF 在tDCS 誘導的突觸可塑性變化中具有重要作用［13］。

2.3 tDCS 對Ca2+濃度的影響 tDCS 能夠引起大腦中Ca2+的積聚。在tDCS刺激的同側大腦半球中，Ca2+積累的程度比在對側大腦半球中更大，并且在海馬和下丘腦皮層中也發現了Ca2+積聚［51］。據報道，tDCS 能夠引起整個大腦皮層星形膠質細胞中Ca2+大幅度激增，同時降低小膠質細胞的活性，增強神經元間的突觸傳遞，但局部場電位并沒有發生明顯的改變［52］。研究表明，tDCS 引起細胞內Ca2+水平增加［13］，主要是由于電壓門控鈣通道的激活引起的。此外，Ca2+濃度的升高對神經元突觸可塑性及動物的抑郁樣行為具有改善作用［53］。

有關tDCS機制研究的總結見表5。

表5 tDCS在嚙齒動物中的作用機制Table 5. The mechanisms of tDCS in rodents

2.4 tACS 的機制 相對tDCS 而言，tACS 的機制研究較少。現有觀點認為tACS 的機制主要是同步化或去同步化神經元網絡，從而改變大腦振蕩節律，但其具體的作用原理尚不明確。tACS在嚙齒類模型中的機制研究主要分為兩方面。一方面，tACS 可以調節興奮性和抑制性皮層神經元的活動，對皮層興奮/抑制平衡產生影響。tACS 可以改變腦內GABA 水平，特別是對GABAA受體介導的神經活動產生影響，在各腦區之間的連接性方面產生調節作用［57］。另一方面，tACS可以直接干擾并調節大腦節律，從而影響認知過程［58］。已有研究對多個皮質區域進行tACS，發現tACS 在較低頻率下可以調節細胞膜電位，引起神經元振蕩，但在較高頻率下卻對大腦神經活動沒有明顯作用［59］。也有研究表明tACS 在麻醉和清醒動物中對其感覺和視皮層具有調節作用［5］，但有研究者提出tACS 的刺激作用是高度依賴動物狀態的，因為深度麻醉本身會影響大腦的振蕩，從而干擾tACS 的刺激效果［60］。此外，還有研究認為tACS 到達皮層的電位較少，不足以引起神經活動。研究證明tACS對運動皮層的作用是由經皮刺激引起周圍神經活動而產生的，并不是由經顱刺激皮層神經活動引起的［61］。因為近75%的電流通過軟組織和顱骨后會衰減，實際到達刺激腦區的電流只有25%，特別是在電極非常靠近時，電流的流失比例會更高，電流更有可能在頭皮上分流［62］。

3 tES的刺激參數

tES 刺激參數設置，如電極極性（tDCS）、刺激頻率（tACS）、電流強度（密度）、刺激時間、重復刺激次數、實驗周期等，以及tES 實驗動物參數，如動物品系、性別、年齡等，對tES 實驗結果都具有較大影響。（1）在小鼠中，通常選擇C57 小鼠或者特定模型的雄性小鼠。對于電極極性而言，陽極刺激的研究較多，其研究進展也較多。研究中所使用的電流密度差異性較大，但使用5.71 mA/cm2電流密度的研究較多，此外，使用電流強度為200～350 μA 的研究也較多。對于刺激次數而言，單次和重復多次的均有使用，且重復刺激的次數也不太統一，但重復10 次的研究較多，刺激的持續時間一般為10～20 min。（2）在大鼠中，通常選擇SD 和Wistar 大鼠或者特定模型的雄性大鼠。對于電極極性而言，也是陽極刺激的研究居多。電流強度（密度）設置的差異性也比較大。對于重復次數而言，單次和重復多次刺激均有使用，且重復次數也不太統一，但刺激的持續時間與小鼠相似，通常為10～20 min。

tDCS應用的腦區會產生不同的效果，位置不同，電流強度也會有少許差異。在小鼠中刺激腦區為額葉皮層、海馬、頂葉皮層、運動皮層、視皮層和聽皮層；而對電極多數置于胸腹部，少數置于肩頸部。在大鼠中的刺激區域與小鼠類似。

4 tES的安全性

對于tES 在嚙齒動物中的安全性分析，目前對tDCS 的關注稍多，但還不夠完善。在tDCS 中其不良反應和癲癇發作風險均很低。當使用atDCS 在20 A/m2的電流密度下觀察到刺激部位病變，該電流密度低于先前報道的ctDCS 為142.9 A/m2的安全閾值［2］。但Jackson等［63］的研究表明，在大腦內部進行tDCS處理期間，當電流密度小于20 A/m2時不會引起運動功能和學習記憶能力損傷；tDCS 對腦形態、神經結構、神經遞質水平或腦溫沒有顯著影響；而電流密度較高的刺激會導致小膠質細胞表型變化。此外，有研究發現ctDCS 在500 μA 的電流強度下對嚙齒動物是安全的，對成年雄性大鼠的運動能力、運動耐力和空間學習記憶等行為指標均沒有影響［64］。相關文獻的數據總結見表6。

表6 tDCS在嚙齒動物中的安全性Table 6. The safety of tDCS in rodents

5 小結

tES 在嚙齒動物（小鼠和大鼠）上的研究進展表明：tES在改善AD、PD、抑郁、癲癇等神經系統疾病方面有潛在作用，也可以有效改善認知、調節運動興奮性等腦功能。這些進展可為后續的tES 相關研究提供參考。一方面，tDCS的研究偏向于功能方面，近年來對tES機制上的研究逐漸增加，但關于功能與機制結合的研究目前較少，期待進一步的研究。另一方面，目前tACS 在嚙齒動物上的基礎研究相對較少，機制研究也較為欠缺，相反，在臨床上的研究較多，因此，可以通過在嚙齒動物模型上的試驗，驗證tACS在臨床上的研究結果，以此進一步探索與促進tACS這種神經調節技術的發展。此外，tES 的刺激參數需要標準化，目前使用的參數不一，從而引起的作用效果差異較大，其中以電流密度至關重要，但這一參數在嚙齒動物的研究尚存較大差異。最后，tES 的安全性也需要開展進一步研究，目前為止，對電流大小和密度以及其它參數的安全閾值報導尚少，因此tES參數設置的安全范圍還有待界定。