蛋白質O-GlcNAc糖基化與心血管疾病*

趙 培， 張佳佳， 龔開政

（揚州大學附屬醫院心血管內科，江蘇揚州 225000）

蛋白質O連接N-乙酰葡萄糖胺糖基化（O-linkedN-acetylglucosaminylation，O-GlcNAcylation；簡稱OGlcNAc 糖基化）是指單個N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，GlcNAc）以O-糖苷鍵連接到底物蛋白質絲氨酸或蘇氨酸殘基上的一種蛋白質翻譯后修飾。生理水平的O-GlcNAc 糖基化在代謝和免疫穩態等方面具有重要作用，其水平異常則與心血管疾病、代謝綜合征和癌癥等疾病的發生密切相關［1-2］。本文著重對近年來心血管疾病中涉及到O-GlcNAc糖基化的研究做簡要綜述，以探究蛋白質O-GlcNAc糖基化在心血管疾病中的作用，以及調控蛋白質OGlcNAc糖基化對心血管疾病的治療意義。

1 O-GlcNAc糖基化的調節酶

與磷酸化一樣，O-GlcNAc 糖基化也是一種常見的翻譯后修飾。這2 種修飾的共同點在于均以蛋白質的絲或蘇氨酸殘基為靶點，不同點在于細胞內調節磷酸化的蛋白激酶和磷酸酶有數百種，而調節OGlcNAc 糖基化的酶僅有一對，即O-GlcNAc 轉移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）和O-GlcNAc水解酶（OGlcNAcase，OGA）。OGT是可溶性蛋白，存在于細胞質、細胞核和線粒體，主要位于細胞核。它由2 個不同的結構域組成：N 端具有一系列34 肽重復序列（tetratricopeptide repeat，TPR），是蛋白質與蛋白質相互作用區域，可識別和激活特異性底物蛋白；C 端是催化區域，具有尿苷二磷酸（uridine diphosphate，UDP）-GlcNAc 結合和酶催化位點。由于TPR 的數量不同，OGT形成了3種異構體，分別是ncOGT（nucleocytoplasmic OGT；分布于細胞核和細胞質，含有13.5個TPR，分子量是116 kD）、sOGT（short OGT；分布于細胞核和細胞質，含有2.5 個TPR，分子量是70 kD）和mOGT（mitochondrial OGT；位于線粒體，含有9 個TPR，分子量是103 kD）［2-3］。OGA 存在于細胞質和細胞核，主要位于細胞質。它由N 端的糖苷水解酶結構域、中間的莖結構域和C 端的乙酰轉移酶結構域3個部分組成。OGA 有2 個異構體，分別是OGA-L（long OGA；分布于細胞質和細胞核，分子量是102 kD）和OGA-S（short OGA；分布于肌漿網和脂滴，分子量是76 kD），兩者的區別在于OGA-S 缺少C 端乙酰轉移酶結構域和部分莖結構域，導致其酶活性顯著降低［2-3］。

OGT 以UDP-GlcNAc 為底物，添加GlcNAc 到蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸殘基上，增加蛋白質OGlcNAc 糖基化水平；相反，OGA 則將GlcNAc 從蛋白質上水解去除，降低蛋白質O-GlcNAc糖基化水平［3］。O-GlcNAc 糖基化除了受到OGT 和OGA 的共同調控外，自身也可反向調節OGT 和OGA 中高度保守滯留內含子的剪接，從而控制mRNA 豐度，以維持自身水平的穩定［4］。但令人困惑的是，OGT 和OGA 這對調節酶如何特異性識別成千上萬的底物蛋白質呢？為了解開這一謎團，研究者做了大量工作，在OGT的底物識別方面取得了一些進展，但有關OGA 的研究成果較少。目前認為OGT的TPR結構域在其中起著關鍵的作用，它不僅是底物蛋白結合區域，也是調控OGT 酶活性和穩定性的重要介質［5-6］。Liu 等［7］利用液相色譜串聯質譜和突變技術發現sOGT 的TPR 結構域Thr12/Ser56位點可發生O-GlcNAc 糖基化，而這一修飾可改變sOGT 的底物選擇性，進而發揮不同的功能。通過采用蛋白質微陣列技術和全蛋白質組學糖基化分析，Joiner 等［5］發現在OGT 的TPR 結構域中，遠離活性位點的天冬氨酸殘基決定著OGT的底物特異性，如果將這些殘基突變為丙氨酸，OGT 的底物特異性也會發生改變。一項有關神經母細胞瘤的研究顯示，OGT通過與p38絲裂原激活蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）相互作用而促進神經絲蛋白重鏈（neurofilament heavy chain，NF-H）的O-GlcNAc糖基化［8］。由于OGT的TPR區域存在多個底物作用位點，我們推測OGT 也可能是通過與一些輔助蛋白相互作用以形成特異性全酶來實現對底物的特異性識別，即OGT 的TPR 區域與某些蛋白的相互作用決定了OGT的底物特異性。

2 己糖胺生物合成途徑和O-GlcNAc糖基化的調控

細胞攝取葡萄糖后，葡萄糖在己糖激酶的催化下轉化成6-磷酸葡萄糖，繼而轉化成6-磷酸果糖。6-磷酸果糖大部分進入糖酵解途徑，但約有2%～3%進入己糖胺生物合成途徑（hexosamine biosynthesis pathway，HBP），在限速酶谷氨酰胺：6-磷酸果糖酰胺基轉移酶（glutamine：fructose-6-phosphate amidotransferase，GFAT）的催化下生成6-磷酸葡萄糖胺，再經過3 步酶促反應，最終生成終產物UDP-GlcNAc［9-10］。UDP-GlcNAc 是小分子高能化合物，在細胞中的數量僅次于ATP，與營養物質的代謝密不可分，其合成受葡萄糖、氨基酸、脂肪酸和核苷酸水平的共同調控［10］，由于UDP-GlcNAc 的產量直接影響蛋白質OGlcNAc糖基化的水平，因此認為蛋白質O-GlcNAc糖基化是細胞營養狀態的感受器。由于三大營養物質之間存在相互轉化，理論上，任何一種物質的代謝異常均有可能引起O-GlcNAc 水平的改變，比如高脂飲食可增加腦動脈O-GlcNAc 糖基化的水平［11］。由此可見，持續的營養過剩勢必導致O-GlcNAc 糖基化水平的慢性升高，進而引發疾病。

目前，增加O-GlcNAc 糖基化水平的手段有：（1）使用葡萄糖胺或谷氨酰胺以增加HBP代謝；（2）使用OGA 抑制劑PUGNAc、Thiamet G、NAG-thiazoline 和NButGT 等；（3）使用OGA的小干擾RNA；（4）利用腺病毒過表達OGT［1］。反過來，抑制O-GlcNAc 糖基化的方法有：（1）使用重氮絲氨酸、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸等抑制GFAT；（2）使用OGT 抑制劑alloxan、TTO4 等；（3）使用底物類似物UDP-5SGlcNAc；（4）使用OGT的小干擾RNA；（5）利用腺病毒過表達OGA；（6）利用Cre-loxP 系統特異性敲除OGT基因［1］。雖然有這么多方法，但酶抑制劑的特異性并不高。比如，alloxan 既可抑制OGT，也可抑制OGA［12］。因而，研發特異性的酶抑制劑對于研究O-GlcNAc 糖基化修飾仍具有重要的意義。

3 蛋白質O-GlcNA糖基化的慢性心血管損害作用

目前認為持續的異常增加的O-GlcNAc 糖基化對人體是有害的。近年來，越來越多的研究證實在多種心血管疾病患者的體內伴隨著慢性的異常增加的蛋白質O-GlcNAc 糖基化，包括動脈粥樣硬化、心肌肥厚和心衰、高血壓和血管功能障礙等。

3.1 動脈粥樣硬化 Shrikhande等［13］發現高糖加速了ApoE-/-糖尿病小鼠動脈粥樣硬化的發生，而抑制O-GlcNAc 糖基化可阻斷高糖的促動脈粥樣硬化作用。更為有趣的是，在不合并糖尿病的ApoE-/-小鼠中，抑制葡萄糖的攝入也可抑制動脈粥樣硬化的形成［14-15］。既往有研究發現小檗堿通過抑制O-GlcNAc糖基化水平進而降低高糖誘導的內皮細胞氧化應激［16］。由此，我們推測通過抑制葡萄糖攝入產生的抗動脈粥樣硬化作用也可能是經由降低O-GlcNAc糖基化水平實現的。那么，在動脈粥樣硬化斑塊中是否存在O-GlcNAc 糖基化修飾呢？為了明確這個問題，我們利用免疫熒光染色技術檢測了大鼠頸動脈球囊損傷后的O-GlcNAc 糖基化情況，結果發現新生內膜中可見明顯的O-GlcNAc 陽性信號（圖1，未發表）。隨后我們對比觀察了人體健康血管和粥樣硬化血管的O-GlcNAc 糖基化情況，結果發現健康內乳動脈中僅見少許散在的O-GlcNAc 陽性信號，而頸動脈硬化斑塊內有大量的O-GlcNAc 陽性信號（圖2，未發表）。另外，我們發現斑塊內大量M1 型巨噬細胞（iNOS+）可被O-GlcNAc 糖基化修飾，而M2 型巨噬細胞（Arg-1+）偶見O-GlcNAc 陽性信號（圖3，未發表）。基于上述實驗，我們認為人動脈粥樣硬化斑塊中存在明顯的O-GlcNAc 糖基化修飾，在巨噬細胞中OGlcNAc 糖基化修飾主要見于M1 型。而有關OGlcNAc 糖基化修飾在人動脈粥樣硬化進程中的具體作用我們實驗室正在做進一步研究。查閱文獻發現已有細胞實驗證實使用OGA 抑制劑Thiamet G 孵育巨噬細胞不僅可增加細胞內O-GlcNAc 糖基化修飾水平，還可促進M1型巨噬細胞中IL-1β的表達，但對M2 型巨噬細胞中Arg-1 的表達無明顯影響［17］，提示O-GlcNAc 糖基化可增強M1 型巨噬細胞的促炎功能。此外，長期暴露于高糖環境或者增加葡萄糖轉運蛋白GLUT1 的表達均可促進巨噬細胞向M1 型轉化［18］。理論上，無論是增加葡萄糖供給還是增加GLUT1表達均可增加UDP-GlcNAc的生成，進而增加蛋白質O-GlcNAc 糖基化。因此推測在人動脈粥樣硬化進程中O-GlcNAc 糖基化很可能通過促進巨噬細胞向M1 型極化，發揮促炎和促動脈粥樣硬化作用。有研究發現在離體心臟中增加O-GlcNAc 糖基化可促進脂質生成［19-20］，推測O-GlcNAc 糖基化也可能是通過誘導脂質代謝異常而促進動脈粥樣硬化形成。

Figure 1. O-GlcNAc modification in neointima after carotid artery balloon injury in rats（unpublished）. SMC：（vascular）smooth muscle cells. The scale bar=50 μm.圖1 大鼠頸動脈球囊損傷后新生內膜中的O-GlcNAc修飾（未發表）

Figure 2. O-GlcNAc modification of normal and atherosclerotic human vessels（unpublished）. SMC：（vascular）smooth muscle cells. The scale bar=50 μm.圖2 人健康血管和粥樣硬化血管的O-GlcNAc修飾（未發表）

Figure 3. O-GlcNAc modification of M1 and M2 macrophages in human carotid atherosclerotic plaques（unpublished）. iNOS：inducible nitric oxide synthase，M1 macrophage marker；Arg-1：arginase-1，M2 macrophage marker. The scale bar=25 μm.圖3 人頸動脈粥樣硬化斑塊中M1和M2巨噬細胞的O-GlcNAc修飾（未發表）

3.2 心肌肥厚和心衰 先前有研究顯示，在壓力超負荷心肌肥厚模型中UDP-GlcNAc濃度顯著增加［21］；在棕色挪威大鼠年齡相關性心肌肥厚過程中GFAT和O-GlcNAc 糖基化水平逐漸增加［22］；而且動物和臨床研究均顯示，心衰時心臟組織中O-GlcNAc 糖基化水平升高［23-24］。有學者推測上述這些代謝產物和酶水平的變化可能是心肌能量代謝模式發生改變所致。正常情況下，成人心臟以脂肪酸氧化為主；而在心肌肥厚和心衰時，心臟脂肪酸氧化減少，碳水化合物氧化增加，類似胎兒心臟代謝模式，使得進入HBP代謝途徑的葡萄糖增多，進而導致UDP-GlcNAc濃度增加、GFAT 活性增強及O-GlcNAc 糖基化水平升高；通過抑制心臟代謝模式的轉變可減輕主動脈弓縮窄所致的心肌肥厚和心衰［25］。該結果支持上述推測，強調了心肌脂肪酸氧化在維持心臟正常結構和功能中的重要性，而調控O-GlcNAc 糖基化水平可能是一個潛在的治療靶標。

也有學者發現蛋白質O-GlcNAc 糖基化與心肌肥厚密切相關［26］。活化T 細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）是具有多向調節功能的轉錄因子，通常以無活性的磷酸化狀態存在于核外，脫磷酸化后激活、入核并激活下游信號分子，促進心肌肥厚相關基因的轉錄。Facundo 等［27］利用主動脈縮窄模型證實抑制O-GlcNAc 糖基化可阻止NFAT 激活及心肌肥厚，推測在心肌細胞肥大過程中NFAT的激活依賴于O-GlcNAc 糖基化修飾。近來有研究發現，AMPK的抗心肌肥厚作用也是通過降低O-GlcNAc糖基化水平實現的［28］。然而，Nakagawa 等［29］發現，提高O-GlcNAc 糖基化水平可抑制NFAT 和NF-κB 啟動子的活性，延緩間隙性缺氧導致的心室重構。上述研究結果的不一致可能與選用不同的疾病模型有關。由于NFAT 上存在有O-GlcNAc 糖基化修飾位點［30］，我們推測NFAT 的O-GlcNAc 糖基化修飾在NFAT 介導的心肌肥厚和心室重構中可能起著關鍵作用。

3.3 高血壓和血管功能障礙 高血壓是心血管疾病的主要危險因素之一。異常的血管活性和內皮反應性，以及對縮血管物質的高敏感性是高血壓和血管功能障礙的共同特點。Lima 等［31］發現，高血壓大鼠的脈管系統中O-GlcNAc 糖基化水平升高，內皮依賴性血管舒張功能受損，對縮血管物質敏感性升高，用OGA 抑制劑PUGNAc 提高O-GlcNAc 糖基化水平可完全模擬出上述血管效應，提示O-GlcNAc 糖基化促進了高血壓的發生發展。Kim 等［32］發現葡萄糖胺也有縮血管作用，而抑制OGT 活性后其縮血管作用消失，OGT 活性抑制后O-GlcNAc 糖基化合成減少，推測葡萄糖胺的縮血管作用可能也是通過提高OGlcNAc 糖基化水平實現的。有關O-GlcNAc 糖基化引起上述血管效應的機制主要有以下幾種觀點：（1）O-GlcNAc 糖基化通過抑制eNOS 磷酸化，減弱其舒血管功能［31-33］；（2）O-GlcNAc 糖基化通過增加血管對α-腎上腺素能受體激動劑的反應性而提高血管張力［31］；（3）O-GlcNAc 糖基化通過激活NADPH 氧化酶而產生過量超氧陰離子，從而減弱血管舒張功能［34］。

內皮素1（endothelin-1，ET-1）是迄今為止發現的最強的縮血管物質，在血管功能紊亂中起關鍵作用。有學者發現ET-1 可抑制OGA 的表達及活性，提高蛋白質O-GlcNAc 糖基化水平；而內皮素受體抑制劑阿曲生坦也可抑制ET-1 引起的O-GlcNAc 糖基化升高。另外，OGT 活性抑制劑在逆轉O-GlcNAc 糖基化水平升高的同時可完全阻斷ET-1 引起的縮血管作用［35］，提示ET-1 的縮血管作用可能是由O-GlcNAc糖基化介導的。

上述研究結果表明異常升高的O-GlcNAc 糖基化水平可能參與了血管功能紊亂及高血壓的形成。

4 蛋白質O-GlcNAc糖基化對急性心血管損傷中心肌和血管的保護作用

自30 多年前美國科學家發現蛋白質存在OGlcNAc 糖基化修飾以來，科學家們一直關注它的慢性損害作用。然而，2004年Zachara等［36］首次提出OGlcNAc 糖基化水平的急性升高具有細胞保護作用；此后，大量研究證實了它對急性心血管損傷中心肌和血管的保護作用。

4.1 對心肌缺血再灌注損傷的作用 體內外研究均觀察到心肌缺血再灌注過程中O-GclNAc 糖基化水平的變化。比如，在新生大鼠心肌細胞的缺氧/復氧研究中，缺氧/復氧可導致細胞內O-GclNAc糖基化水平上升［37］；在離體心臟的缺血再灌注研究中，缺血再灌注后心臟O-GclNAc 糖基化水平顯著下降［38］；在動物的在體心肌缺血再灌注研究中，缺血預處理可提高O-GclNAc 糖基化水平［39］。在上述研究中，雖然O-GlcNAc 糖基化水平變化趨勢不一致，但外源性提高O-GlcNAc 糖基化水平均可減少心肌細胞死亡，縮小心肌梗死面積，保護心功能［37-39］。Jensen 等［40］提取了人的右心房組織進行離體缺血再灌注研究，他們發現O-GlcNAc 糖基化參與介導了缺血預適應誘導的心臟保護作用。臨床上對手臂進行間歇性短時間缺血和再灌注刺激可提高心肌梗死患者的心肌存活率［41］，即遠程缺血預處理具有心臟保護作用。研究發現遠程缺血預處理可增加心房小梁的O-GlcNAc水平，而阻礙O-GlcNAc 增加后心臟保護作用消失［40］，提示O-GlcNAc 在遠程缺血預處理介導的心臟保護中也起著關鍵作用。

4.2 對急性血管損傷的作用 由前可知，異常升高的O-GlcNAc 糖基化水平促進了血管功能紊亂和高血壓的形成。令人意外的是，O-GlcNAc 糖基化水平的急性升高具有血管保護作用。Oparil實驗室發現，O-GlcNAc 水平在頸動脈內膜損傷后迅速下降，并持續長達24 h 以上；通過給予葡萄糖胺或OGA 抑制劑PUGNAc 來升高受損血管的O-GlcNAc 糖基化水平，可減少急性炎癥介質的表達；如果持續給予葡萄糖胺治療14 d 則可顯著抑制新生內膜的增生［42］。在血管內膜增生中平滑肌細胞為主導細胞，因此，該團隊又進行了細胞研究，他們發現提高O-GlcNAc 糖基化水平可抑制血管平滑肌細胞中TNF-α 誘導的炎癥介質表達，并且認為O-GlcNAc 糖基化的抗炎作用是由于NF-κB 的p65 亞基發生O-GlcNAc 糖基化修飾后NF-κB 信號通路受抑制所致［43］。此外，Hilgers 等［44］發現提高O-GlcNAc 糖基化水平可抑制離體主動脈中TNF-α誘導的內皮功能紊亂。

4.3 對心臟干細胞的保護作用 有研究顯示，OGlcNAc 糖基化可部分調節胚胎干細胞的多能性和重編程［45］。隨后，Zafir 等［46］探討了O-GlcNAc 糖基化在心臟干細胞中的作用，他們發現在心臟干細胞缺氧/復氧過程中蛋白質O-GlcNA 糖基化水平呈時間依賴性升高［46］。進一步研究發現，降低O-GlcNA 糖基化水平可減弱心臟干細胞的抗缺氧能力，而提高O-GlcNAc 糖基化水平可提高心臟干細胞的存活率。近年來，心臟干細胞移植已成為急性心肌梗死治療的一種新方法，但移植后細胞的低存活率是亟待解決的問題之一。理論上，移植前在體外預先提高心臟干細胞的O-GlcNAc 糖基化水平有望提高其在梗死心肌局部的存活率，但這有待進一步驗證。

5 調控蛋白質O-GlcNAc糖基化對心血管疾病的治療意義

O-GlcNAc 糖基化對心血管系統的作用主要取決于刺激的持續時間。在急性心血管損傷中，OGlcNAc 糖基化水平的短期升高經由抗炎和介導缺血預適應等機制發揮心肌和血管的保護作用［40，43］。如果這一保護作用可被進一步證實，那么在進行心臟移植術和冠狀動脈搭橋術等手術前，通過藥物抑制OGA活性來提高O-GlcNAc糖基化水平，或者通過基因工程手段提高O-GlcNAc 糖基化水平，有望保護心臟和血管，改善心功能，提高生存率。相反，在心力衰竭等慢性心血管疾病中，O-GlcNAc 糖基化的慢性增加將損害心臟的正常功能。新近有學者利用OGT和OGA轉基因小鼠模型證實，過度的O-GlcNAc糖基化可抑制線粒體復合體I的活性，致使線粒體能量產生功能受損，進而促進心力衰竭和死亡的發生［47］。機制方面的研究有待進一步深入。在將來，以下幾點仍需著重探討：在心血管疾病發生發展中哪些蛋白質的O-GlcNAc 糖基化修飾水平是發生變化的（升高或降低）？蛋白質O-GlcNAc 糖基化修飾的具體位點？O-GlcNAc 糖基化修飾對靶蛋白功能的影響？毫無疑問，這些問題的明確將使通過外源性調控靶蛋白O-GlcNAc 糖基化水平來治療心血管疾病成為可能。考慮到O-GlcNAc 糖基化在人體疾病中的復雜作用，針對不同疾病給予器官特異性、蛋白質靶向性的O-GlcNAc糖基化調控更具可行性。

總而言之，O-GlcNAc 糖基化水平的短期急性升高對急性心血管損傷中的心肌和血管具有保護作用，而O-GlcNAc 糖基化的長期慢性增加參與了慢性心血管疾病的發生發展。深入探討O-GlcNAc 糖基化在心血管疾病發生發展中的作用，有助于我們深入理解心血管疾病的發病機制，從而為臨床研發新藥提供理論依據。