熄風定喘方對寒哮型哮喘模型豚鼠氣道炎癥的影響*

陳夢瑤，尚莉麗

1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031

支氣管哮喘（以下簡稱“哮喘”）是小兒常見的以慢性氣道炎癥為特征的異質性疾病［1］，其發病機制主要是Th1／Th2細胞因子失衡［2］，主要采用支氣管舒張劑聯合糖皮質激素霧化吸入治療，雖然起效快，癥狀緩解迅速，但存在復發率高、不良反應等不足［3］。Meta分析顯示，中醫藥在防治哮喘方面具有一定優勢［4］。本課題所研究的熄風定喘方，是尚莉麗教授的自擬方，以小青龍湯為主方，佐以全蝎、僵蠶、地龍等熄風止痙的蟲類中藥組成。針對哮喘，大多數學者認為小青龍湯的治療作用集中表現為抑制炎癥反應以平喘［5-7］，熄風止痙類中藥有解肌平喘的功效［8］。前期臨床研究顯示，以小青龍湯為主方的咳喘平顆粒可通過下調抑炎因子、上調促炎因子而控制炎癥反應以發揮治療作用，但加用熄風止痙類中藥后作用機制不清楚。血清肥大細胞羧肽酶（mast cell carboxypetidase，MC-CP）、免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）是Th2細胞因子（抑炎因子）的代表，γ-干擾素（interferonγ，IFN-γ）是Th1細胞因子（促炎因子）的代表，其在哮喘發病機制中研究較少［9］。因此，本研究主要探討熄風定喘方對寒哮型哮喘模型豚鼠氣道炎癥的影響，以其為臨床提供基礎。

1 材料

1.1 動物普通級雄性豚鼠72只，3～4周齡，體質量（165±15）g，由南京市浦口區菜芙養殖場提供，蘇州大學技術與環境研究所質檢，合格證號SCXX（蘇）2019-0005。動物飼養于安徽中醫藥大學（梅山路校區）實驗動物中心，自然采光，室內溫度（23±2）℃，相對濕度50%～70%，飼養環境安靜通風。本實驗符合安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會的相關規定和要求，倫理批號：AHUCMguinea pigs2020007。

1.2 藥物與試劑熄風定喘方（炙麻黃5 g，炒白芍10 g，細辛3 g，炙甘草3 g，干姜3 g，桂枝6 g，醋五味子6 g，姜半夏10 g，炒杏仁10 g，全蝎3 g，僵蠶10 g，地龍10 g，以上均為單味顆粒劑，由安徽中醫藥大學第一附屬醫院提供）；地塞米松片（上海上藥信宜藥廠有限公司，批號：2980605）。卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美國Sigma公司，批號：A5253）；氫氧化鋁Al（OH）3佐劑（天津市凱通化學試劑有限公司，批號：HG3185782）；氨基甲酸乙酯（美國Aladdin公司，批號：U108629）；生理鹽水（上海第一生化藥業公司，批號：060210）；MC-CP試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司，批號：20201109）；IFNγ、IgE試劑盒（武漢基因美科技有限公司，批號：GR2021-01、GR2021-01）。

1.3 儀器酶標儀（雷杜，型號：RT-6000）；離心機（安徽嘉文，型號：JW3021HR）；漩渦混合器（其林貝爾儀器制造公司，型號：GL-88B）；電熱恒溫箱（上海三發，型號：DNP-9052BS-Ⅲ）。

2 方法

2.1 模型復制將72只豚鼠隨機選擇12只為正常組，其余豚鼠分別于第8天和第15天腹腔注射1 mL致敏液（100μg OVA＋1 mg Al（OH）3）致敏，第22天開始用1%OVA霧化激發，每次30 min，結束后給予寒冷刺激1 h，連續霧化7 d，從而激發豚鼠哮喘；正常組用生理鹽水替代致敏和霧化，其余操作相同。

2.2 動物分組與給藥待豚鼠出現張口呼吸伴喘息、頻率加快、腹部翕動、躁動不安、搔抓顏面皮毛、咳嗽時發毛豎立，易激惹等現象說明成功引發豚鼠哮喘，引喘成功后，將模型隨機分為模型組、熄風定喘方低劑量組（5.68 g·kg-1）、熄風定喘方中劑量組（11.36 g·kg-1）、熄風定喘方高劑量組（22.72 g·kg-1）和地塞米松組（5 mg·kg-1），每組各12只豚鼠，各組給予相應的藥物21 d。

2.3 觀察豚鼠的一般行為學觀察各組大鼠體質量、神態、飲食、呼吸、紫紺、毛色等情況進并進行記錄。

2.4 檢測血清相關指標末次給藥后的2 h后，以20%烏拉坦（1.5 g·kg-1）腹腔注射豚鼠，輔助動脈取血后，檢測血清中的MC-CP、IgE、IFN-γ水平。

2.5 HE染色觀察肺組織病理形態變化取血后剖胸，取右肺上葉組織置于40 ng·L-1多聚甲醛中固定，并按照HE染色的步驟進行切片的制備，在顯微鏡下觀察氣道炎性細胞浸潤情況、肺泡及支氣管結構、氣道上皮損傷等病理形態改變。

2.6 統計學方法采用SPSS 23.0軟件進行統計分析，計量資料以均值±標準差（±s）表示，先正態檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊，組間兩兩比較采用LSD檢驗，若方差不齊，組間比較采用Dunnett’s T3法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組豚鼠的一般情況正常組豚鼠皮毛光澤、活動自如、反應靈敏、呼吸平穩、毛色光潔、飲食正常；模型組豚鼠出現呼吸加快、張口喘息、口唇發紺、腹部翕動、四肢癱軟、煩躁不安、搔抓顏面皮毛、咳嗽時毛發豎立、被毛逆亂、易激惹等現象，且皮毛干枯、稀疏，飲水量增多，活動頻率與食欲減少，反應遲鈍，身材瘦削，體重減輕；熄風定喘方低、中、高劑量組與地塞米松組豚鼠亦出現喘息，但癥狀較輕，且時而躁動、激惹征等表現較模型組不明顯，被毛順滑、顏面皮毛潤澤、行動靈活、食欲較模型組有改善。

3.2 各組豚鼠血清中MC－CP、IgE、IFN－γ結果比較與正常組比較，模型組豚鼠血清中MC-CP、IgE水平極顯著升高（P＜0.01），IFN-γ水平極顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，熄風定喘方低、中、高劑量組及地塞米松組豚鼠血清中MC-CP、IgE水平顯著降低（P＜0.05），IFN-γ水平顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組豚鼠血清中MC－CP、IgE、IFN－γ水平比較（±s）

表1 各組豚鼠血清中MC－CP、IgE、IFN－γ水平比較（±s）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05

組別 n 劑量 MC-CP LgE IFNγ正常組12 - 2.04±0.29 2.82±0.19 66.78±5.69模型組 12 - 10.75±0.71＃＃ 12.88±1.12＃＃ 14.45±3.90＃＃熄風定喘方低劑量組 12 5.68 g·kg-1 7.48±0.90* 6.37±0.45* 20.87±1.98*熄風定喘方中劑量組 12 11.36 g·kg-1 6.77±0.99* 5.25±0.66* 29.41±3.40*熄風定喘方高劑量組 12 22.72 g·kg-1 3.99±0.74* 3.99±0.43* 31.87±5.06*地塞米松組 12 5 mg·kg-1 4.32±0.64* 4.17±0.32* 22.39±3.54*

3.3 各組豚鼠肺組織病理結果正常組豚鼠肺組織結構正常，組織內未見水腫部位，氣管黏膜上皮完整，管腔內光滑平整無黏液、無狹窄及炎癥細胞浸潤；模型組豚鼠病變部位見明顯水腫，管腔狹窄，黏液細胞不規則增生，可見黏液栓，上皮細胞壞死脫落，管壁有大量炎性細胞浸潤，基底膜厚度明顯增加；地塞米松組豚鼠肺組織黏膜仍有充血水腫和炎細胞浸潤，但較模型組明顯減輕，病變處只見少量炎細胞浸潤，管腔寬度較模型組明顯擴大且無明顯黏液栓形成，上皮結構也較完整；熄風定喘方低劑量組豚鼠肺組織管腔狹窄、管壁炎性細胞浸潤等程度亦有所降低；熄風定喘方中劑量組的管腔縮小，壁內見少許炎性細胞；熄風定喘方高劑量組豚鼠肺組織管腔擴大，壁內無明顯炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組豚鼠肺組織病理形態觀察（HE染色，×400）

4 討論

哮喘是小兒常見的一種變態反應性疾病，其發病機制主要表現為氣道炎癥、免疫與變態反應、氣道神經調節和遺傳等方面，主要以嗜酸性粒細胞和肥大細胞為主，包括T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等多種細胞組分參與［10］。研究發現，哮喘重要的發生機制是T細胞（Th1／Th2）的免疫調節失衡，表現為Th2細胞因子功能相對激發，Th1細胞因子功能相對受抑制［11］。Th1細胞因子分泌的減少和Th2細胞因子分泌的增加，均直接或間接增加IgE的合成，誘導肥大細胞和嗜酸性粒細胞脫顆粒，發生氣道炎癥反應［12］。其中肥大細胞分泌出一種重要的炎癥介質——MC-CP［13-14］，約占肥大細胞蛋白總量的12%，對肥大細胞分化起重要作用。當哮喘患兒接觸致敏原后，機體出現IgE橋聯，引發肥大細胞內一系列信號轉導［15］。研究表明，在嚴重的急性變態反應發生過程中，患兒血液或體液中會存在大量肥大細胞釋放的活化脫顆粒，致使MC-CP水平在血液及體液中急劇升高而加劇炎癥反應［16］。哮喘急性發作患者血液中MC-CP水平與IgE呈正相關［9］。作為Th1細胞因子的代表IFN-γ，其原名為巨噬細胞活化因子，可以調節哮喘小鼠Th1／Th2平衡，抑制杯狀細胞增生，減輕呼吸道阻力［17］。IFN-γ不僅能促進Th0向Th1細胞分化，增強自然殺傷細胞免疫應答，還可以抑制Th2細胞表型的分化和功能，加強巨噬細胞的活化補體等，對免疫調節系統具有重要作用，有助于對細胞內病原體進行清除［18］。研究發現，IFN-γ能抑制Th2細胞分泌的白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4），進而抑制IgE的合成，減輕氣道的慢性炎癥，避免患者哮喘的進一步發展［19-20］。

支氣管哮喘屬于中醫“哮病”的范疇，《證治匯補》闡述其病機責之于胸中氣之壅塞，膈間又有頑痰之膠著，再有外寒之侵襲，導致氣道不暢，發為哮喘［21］。哮喘發作的內在病因合為“伏風”與“痰飲”［22］，即常因感受外邪或接觸異物而誘導伏風發動，即外風引動內風則哮喘發作。哮病有寒熱之分，冷哮最為常見。全身或局部應用糖皮質激素是治療哮喘的首選，但長期應用會出現激素依賴性和抑制免疫細胞，從而加重或誘發感染等不良反應。中醫治療可以調控患者自身的免疫機制，改善患者的氣道反應以及細胞、介質等水平，改善臨床癥狀［23］。哮喘發作期，外風引動內風，來勢洶洶，喘息明顯，肺失宣肅，即急則治其標，結合歷代醫家觀點冷哮型哮喘宜溫化或宣散，尚莉麗教授認為輔以熄風止痙藥物，更以祛毒平喘。本研究中的熄風定喘方是尚莉麗教授的經驗方，以小青龍湯為基礎加減化裁而成，組方為炙麻黃、炒白芍、細辛、干姜、炙甘草、桂枝、醋五味子、姜半夏、炒杏仁、全蝎、僵蠶、地龍。熄風定喘方在辨寒熱的基礎上，重用全蝎、僵蠶、地龍等蟲類藥，正如葉天士所言：“初為氣結在經，久則血傷入絡，輒仗蠕動之物松透病根”［24］。此類中藥因其性擅走竄、無所不至，故可深入肺絡搜邪、祛除內風與毒邪，最終使肺氣宣降得宜、內風得息、氣道攣急得以緩解。

小青龍湯作為熄風定喘方的基礎方，臨床主治外寒內飲，具有抗感染、平喘、抗過敏等作用，能夠改善肺部通氣狀況、干預氣道重塑［25］。研究發現，小青龍湯不僅可以抑制IgE的生成，拮抗氣道變應性炎癥［26］，還可抑制氣道重塑、降低氣道反應性［11］等，以改善支氣管哮喘患者咳嗽、喘息、咯痰等臨床癥狀。配伍的全蝎、僵蠶、地龍等蟲類藥有減輕呼吸道炎癥，緩解支氣管痙攣等作用［27］。其中僵蠶能夠減少IL-4水平，調節Th1／Th2平衡控制氣道炎癥；全蝎具有免疫抑制、改善慢性氣道炎癥，實現氣道重構；地龍具有舒緩氣道平滑肌痙攣，有效擴張支氣管的作用，因此其止咳平喘效果顯著［3］。

基于以上研究，本研究復制出適應熄風定喘方組方特點的實驗動物模型，選取MC-CP、IgE、IFN-γ為寒性哮喘豚鼠的檢測指標，并結合豚鼠肺組織病理，更準確地揭示熄風定喘方治療哮喘的藥效。本研究結果發現，與模型組比較，熄風定喘方組豚鼠的行為學有改善；豚鼠血清MC-CP、IgE水平顯著降低，IFN-γ水平顯著升高，病理結果顯示豚鼠肺組織炎癥浸潤減輕。提示熄風定喘方可能通過降低哮喘豚鼠MC-CP、Ig-E水平、升高IFN-γ水平，改善肺功能以防治哮喘氣道炎癥。