黃連素治療糖尿病腎病鼠和人的系統評價*

吳偉，馮儒庭，韓琳

1.九江學院附屬醫院，江西 九江 332000；2.江西中醫藥大學附屬醫院，江西 南昌 330000

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的慢性微血管并發癥之一，發病率呈逐年增長趨勢［1］，發病機制尚不完全清楚，疾病最終將進展至終末期腎衰竭，給患者、家庭、社會帶來沉重負擔，這就需要醫藥工作者探索新的治療方法。黃連素來源于黃連、黃柏等含小檗堿的中藥，屬異喹啉生物堿，亦可人工合成。目前多項動物和臨床研究發現，黃連素可降低血糖、降低血脂、減輕炎癥反應等保護腎臟［2］。系統評價是全面收集符合研究問題的文獻進行定性，并嚴格評估文獻，最后提供可靠的研究結果，被公認為是衛生保健決策的高質量研究［3］。本研究將對黃連素治療DN的動物和臨床研究進行全面評價和比較，旨在發現黃連素對DN的治療作用，也為DN的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 納入標準所有黃連素和小檗堿治療DN的動物和臨床研究均被納入。

1.2 排除標準排除非DN的研究、非隨機對照試驗研究、細胞研究、綜述研究、聯合用藥研究、雷同和重復的研究。

1.3 資料來源與檢索策略兩名研究者（馮儒庭、韓琳）獨立用“黃連素”或“小檗堿”和“DN”或“糖尿病”“腎”或“蛋白尿”或“尿蛋白”為主題詞分別檢索中國知網數據庫、萬方數據庫、維普數據庫，中國生物醫學文獻數據庫；用“berberine”和“diabetic nephropathy”或“diabetic”“renal”或“kidney”主題詞檢索Pubmed數據庫，檢索時間均是建庫時間至2019年12月31日。手工檢索中國中西醫結合學會腎臟病專業委員會學術大會、中華中醫藥學會糖尿病分會會議等重要會議論文匯編，檢索截止時間至2019年12月31日。

1.4 資料提取兩名研究者（吳偉、韓琳）獨立地對納入研究進行資料提取，提取內容包括論文題目、作者、發表年份、受試對象或動物種屬特征、研究設計、干預措施、不良事件、結果指標和結論等，完成后相互核對，如有不同，由第三者（馮儒庭）協助判斷。

1.5 質量評價動物實驗文獻質量評價選擇ARRIVE指南［4］和SYRCLE動物實驗偏倚風險［5］評估工具。臨床試驗文獻質量評價選擇2010年版CONSORT聲明和Cochrane風險偏倚評估工具［6］。

1.6 統計學方法動物和臨床研究分別進行系統評價和Meta分析，并運用RenMan 5.1軟件進行操作，計數資料用比值比或相對危險度為合并效應量，計量資料用均數差或標準化均數差為合并效應量；因造模方式、給藥劑量等不同，應用亞組分析；若I2≥50%，選隨機效應模型分析，若I2＜50%，選固定效應模型分析；同質性較好的資料應用敏感性分析；不能合并的資料，進行描述性評價；繪制漏斗圖分析發表偏倚情況；最后對結果進行分析討論。

2 結果

2.1 文獻檢索結果初檢文獻包括中文文獻101篇，英文文獻30篇，閱讀論文逐一篩選，最終納入分析有29篇文獻，排出細胞研究21篇、非DN研究12篇、綜述9篇、聯合用藥14篇、非隨機對照研究2篇、數據不全2篇、撤稿2篇、雷同文獻40篇（雷同文獻選用數據最新或最全者）。檢索流程見圖1。

圖1 文獻檢索流程圖

2.2 文獻基本特征29篇文獻包括中文23篇、英文6篇，均為隨機對照實驗，研究地點均在中國。動物實驗26篇［7-32］，均是大鼠或小鼠的研究，造模方式有誘發性糖尿病模型［四氧嘧啶（200 mg）腹腔注射［7，11］，鏈脲佐菌素（50～150 mg·kg-1）腹腔注射［8-10，13，15，20，24，27-28，30，32］，高脂飼料聯合鏈脲佐菌素（25～60 mg·kg-1）腹腔注射或尾靜脈注射［12，14，16-19，22-23，31］，單 腎 切 除 聯 合 鏈 脲 佐 菌 素（60 mg·kg-1）腹腔注射［25］］和自發性糖尿病模型（Zucker大鼠8周齡［21，26］、KKAy小鼠8周齡［29］），成模標準為空腹血糖＞11.1～16.7 mmol·L-1。給藥方式均是灌胃，給藥劑量在25～400 mg·kg-1，給藥療程在4～20周。臨床試驗3篇［33-35］，均是DNⅢ期的研究，對照組均為空白對照，給藥劑量為20～300 mg·kg-1，觀察療程為3周～6個月。

3 結果

3.1 報告規范參照ARRIVE指南，26篇動物實驗均對標題、摘要、背景、目的、實驗步驟、實驗動物、樣本量、動物實驗分組、實驗結果、統計學方法、基線數據、統計學分析、結果和評價等有完整描述；14篇［7-12，14，21，27-32］對倫理聲明有描述；6篇［8，15，22-23，25，31］對不良事件有描述；16篇［7-8，10-11，13-16，18，24-25，27，19-32］對基金支持有描述；26篇對研究設計描述不完整，均未描述實驗是否施盲，2篇［21，23］描述了實驗單位；9篇［8，14-17，18，22，27，32］對飼養場所和飼養描述不完整，未描述實驗溫度和濕度、動物進食進水情況；26篇對詮釋／科學內涵描述不完整，均未描述3R原則的意義；20篇［9，11-12，14，16-22，24-32］對概括／轉換有描述，認為可以進一步研究或在臨床應用。

參照2010年版CONSORT聲明，3篇臨床試驗對標題與摘要、引言、試驗設計、研究對象、干預措施、結局指標、統計學方法、基線數據、可推廣性等有完整描述；3篇均未描述樣本量的確定方法、分配隱藏、盲法、局限性、試驗注冊；1篇［33］描述了隨機方法，1篇［33］描述了危害，1篇［34］描述了資助。

3.2 方法學質量評價參照SYRCLE動物實驗偏倚風險評估工具，26篇動物文獻在選擇、實施和測量偏倚均呈高度偏倚風險；失訪和報告偏倚均呈低度偏倚風險；其他偏倚均呈偏倚風險不確定。

參照Cochrane風險偏倚評估工具，3篇臨床試驗在選擇偏倚1篇［33］呈低度偏倚風險，2篇呈高度偏倚風險；實施和測量偏倚均呈高度偏倚風險；隨訪和報告偏倚均呈低度偏倚風險；其他偏倚均呈偏倚風險不確定。

3.3 模型評價目前，尚無DN動物模型標準［36］，不同模型或將探索與人類更加接近的疾病過程。比較26項動物實驗的正常組與模型組的血糖、尿蛋白、腎功能，均有統計學意義（P＜0.05），自發性、誘發性模型腎臟病理學變化，均表現為腎小球擴張或系膜基質增生，與人類早期DN病理損傷腎小球代償性增大、系膜基質增多相同，結合尿蛋白、腎功能結果，認為DNⅢ期模型均制備成功。

3.4 Meta分析Meta分析，即定量系統評價，它是全面收集符合納入標準的研究，并進行定量合成，從而得出綜合結論的研究方法，是高級別循證證據之一。

3.4.1 尿蛋白 動物實驗中有15篇研究報道了尿蛋白。8篇［9-11，13，21，23-24，27］檢測了24 h尿蛋白，6篇［7，15-16，29，31-32］檢測了24 h尿白蛋白，1篇［8］檢測了尿白蛋白排泄率，故進行亞組分析。結果顯示：I2＝79%，SMD＝-2.48，95%CI（-3.2，-1.76），P＜0.01，黃連素組較模型組可降低尿蛋白水平。在各亞組研究中，兩組差異均有統計學意義（P＜0.01），見圖2。臨床試驗有1篇［33］研究報道了尿蛋白，黃連素組較空白對照組可明顯降低尿白蛋白排泄率（P＜0.05）。以上結果均提示，動物實驗與臨床試驗的結果具有一致性，黃連素可降低尿蛋白水平。

圖2 動物實驗黃連素組與模型組尿蛋白比較的Meta分析

3.4.2 腎臟指數 動物實驗中有13篇研究報道了腎臟指數。因造模方式不同，故進行亞組分析。結果顯示：I2＝85%，SMD＝-2.59，95%CI（-3.48，-1.69），P＜0.01，黃連素組較模型組可減輕相對腎臟質量。其中1篇［29］自發性模型和12篇［7-11，13，16，19，22-23，27，32］誘發性模型的亞組研究發現，黃連素組較模型組可減輕相對腎臟質量（P＜0.01），見圖3。DN發病機制復雜，不同模型研究，揭示藥物對多種致病因素的作用，有利于發現藥物多靶點機制，對DN的多途徑進行控制。

圖3 動物實驗黃連素組與模型組腎臟指數Meta分析

3.4.3 血肌酐 動物實驗中有19篇研究報道了血肌酐。因造模方式不同，故進行亞組分析。結果顯示：I2＝97%，MD＝-22.58，95%CI（-28.54，-16.62），P＜0.01，黃連素組較模型組可降低血肌酐水平。其中18篇［7，9-16，21-24，26-27，29，31-32］未單腎切除和1篇［25］單腎切除的亞組研究發現，黃連素組較模型組可降低血肌酐水平（P＜0.01），見圖4。臨床試驗有2篇［34-35］研究報道了血肌酐，黃連素組較空白對照組不能降低血肌酐水平，結果顯示：I2＝0%，MD＝-2.42，95%CI（-6.0，1.17），P＞0.05，見圖5。動物研究與臨床研究不一致，與樣本量有關，也與動物實驗模型組只給予生理鹽水，臨床試驗對照組有基礎降糖作用，血糖對模型組腎臟損傷也有關，有待今后大樣本研究證實。

圖4 動物實驗黃連素組與模型組血肌酐Meta分析

圖5 臨床試驗黃連素組與對照組血肌酐Meta分析

3.4.4 血糖 動物實驗中有19篇研究報道了血糖。因造模方式不同，故進行亞組分析。結果顯示：I2＝91%，MD＝-8.75，95%CI（-10.49，-7.01），P＜0.01，黃連素組較模型組可顯著降低血糖水平。其中17篇［7-11，13，15-17，21-25，27，30-32］誘 發 性 模 型 和2篇［21，29］自發性模型的亞組研究發現，黃連素組較模型組可降低血糖水平（P＜0.01），見圖6。臨床試驗有3篇研究報道了血糖，黃連素組較空白對照組可降低血糖水平，結果顯示：I2＝91%，MD＝-1.23，95%CI（-2.39，-0.06），P＜0.05，見圖7。動物研究與臨床研究結果是一致的。

圖6 動物實驗黃連素組與模型組血糖Meta分析

圖7 臨床試驗黃連素組與對照組血糖Meta分析

3.4.5 胰島素 動物實驗中有4篇研究報道了胰島素。因造模方式不同，故進行亞組分析。結果顯示：I2＝95%，MD＝0.10，95%CI（-1.74，1.93），P＞0.05，黃連素組較模型組對胰島素水平無影響。其中2篇［17，23］誘發性模型和2篇［21，26］自發性模型的亞組研究發現，黃連素組較模型組對胰島素水平無影響（P＞0.05），見圖8。推測黃連素降糖可能不依賴于胰島素水平。

圖8 動物實驗黃連素組與模型組胰島素Meta分析

3.4.6 膽固醇 動物實驗有6篇研究報道了膽固醇。因造模方式不同，故進行亞組分析。結果顯示：I2＝98%，MD＝-1.95，95%CI（-2.72，-1.18），P＜0.01，黃連素組較模型組可降低膽固醇水平。其中5篇［16，17，21-22，26］高脂飲食和1篇［9］非高脂飲食的亞組研究發現，黃連素組較模型組可降低膽固醇水平（P＜0.01），見圖9。臨床試驗有1篇［34］研究報道了黃連素組較空白對照組可降低膽固醇水平（P＜0.05）。

圖9 動物實驗黃連素組與模型組膽固醇Meta分析

3.4.7 三酰甘油 動物實驗有6篇研究報道了三酰甘油。因造模方式不同，故進行亞組分析。結果顯示：I2＝97%，MD＝-1.22，95%CI（-1.90，-0.53），P＜0.01，黃連素組較模型組可降低血漿三酰甘油水平。其中5篇［16，17，21-22，2］］高脂飲食和1篇［9］非高脂飲食的亞組研究發現，黃連素組較模型組可降低血漿三酰甘油水平（P＜0.01），見圖10。臨床試驗有1篇［34］研究報道了黃連素組較空白對照組可降低血漿三酰甘油水平（P＜0.05）。

圖10 動物實驗黃連素組與模型組三酰甘油Meta分析

3.5 描述性分析

3.5.1 PI3K 有1篇［18］研究報道了黃連素組較模型組能上調腎臟組織PI3K表達。提示腎臟保護作用可能與黃連素上調腎臟PI3K表達有關。

3.5.2 Nrf2 有1篇［20］研究報道了黃連素組較模型組能上調腎臟組織Nrf2表達。提示腎臟保護作用與黃連素上調腎臟Nrf2表達有關。

3.5.3 TLR4 有1篇［28］研究報道了黃連素組較模型組能下調腎臟組織TLR4表達。提示腎臟保護作用與黃連素下調腎臟TLR4表達有關。

3.6 敏感性分析排除由于動物種屬、造模方式、給藥療程不同增加異質性對結果的影響，故進行敏感性分析進一步評價黃連素的療效。誘發性模型中有2篇［10，27］研究動物種屬、造模方式、給藥療程相同。

3.6.1 24 h尿蛋白 黃連素組與模型組比較，Meta分析示：I2＝0%，MD＝-1.37，95%CI（-2.07，-0.66），P＜0.01，黃連素組較模型組能降低24 h尿蛋白水平。見圖11。

圖11 動物實驗黃連素組與模型組尿蛋白敏感性分析

3.6.2 腎臟指數 黃連素組與模型組比較，Meta分析示：I2＝49%，MD＝-0.45，95%CI（-0.51，-0.39），P＜0.01，黃連素組較模型組能降低腎臟指數。見圖12。

圖12 動物實驗黃連素組與模型組腎臟指數敏感性分析

3.6.3 血肌酐 黃連素組與模型組比較，Meta分析示：I2＝0%，MD＝-50.49，95%CI（-61.18，-39.81），P＜0.01，黃連素組較模型組能降低血肌酐水平。見圖13。

圖13 動物實驗黃連素組與模型組血肌酐敏感性分析

3.6.4 血糖 黃連素組與模型素組比較，Meta分析示：I2＝0%，MD＝-10.64，95%CI（-13.56，-7.71），P＜0.01，黃連素組較模型組能降低血糖水平。見圖14。

圖14 動物實驗黃連素組與模型組血糖敏感性分析

3.7 漏斗圖發生偏倚很難避免，在實施Meta分析時，必須對存在的偏倚的可能性進行檢測。最常用的就是漏斗圖法，漏斗圖的表達方式可以比較直觀的目測有無偏倚。漏斗圖不對稱越明顯，存在發表偏倚的可能性就越大。一般推薦Meta分析的研究對象在10個及以上才需做漏斗圖。動物實驗中血糖的報道的文獻數量最多，故進行有血糖研究的漏斗圖顯示：圖形不對稱，認為存在發表偏倚，見圖15。臨床試驗只有3篇文獻，文獻數量少，未進行漏斗圖檢測。

圖15 含血糖研究文獻的漏斗圖

3.8 不良事件動物實驗有6篇研究報道了不良事件，均是誘發性模型。3篇［22-23，31］是造模失敗，3篇［8，15，25］是實驗中有大鼠死亡，死亡原因有高血糖、感染、灌胃窒息。臨床試驗有1篇描述試驗中無不良事件發生。其他研究未報告不良事件，可能也并無不良事件發生。

4 討論

目前，DN的發病機制尚不明確，也無特效療法。通過動物實驗研究則可直接探索疾病過程，也可發現有療效的藥物。系統評價動物實驗可進一步驗證實驗結論，可靠性較強。對動物實驗和臨床試驗進行全面系統評價和Meta分析，將肯定動物模型的再現性、動物實驗研究的價值，并發現大樣本的治療效果、分析治療結果的同異性，藥物作用和疾病發生機制，以增強臨床療效，兩者也都是循證決策的依據［37］。

本研究參照ARRIVE指南和SYRCLE動物實驗偏倚風險評估兩種工具，有力地評價了文獻質量，也指明了今后研究方向。26篇動物實驗文獻報告欠完整，尤其對研究設計中施盲、詮釋／科學內涵中3R原則的描述不足，方法學質量存在一定的偏倚風險，對分配隱藏、盲法實施的不夠。參照2010年版CONSORT聲明和Cochrane風險偏倚評估兩種工具，更加說明了文獻質量的高低，指導今后研究的質量要求。3篇臨床試驗文獻報告亦欠完整，對方法、討論描述的不完整，方法學質量也存在一定的偏倚風險。

本研究發現，多種自發性、誘發性動物模型均呈現DNⅢ期的表現，可再現黃連素對早期DN的治療作用。系統評價和Meta分析顯示，黃連素在動物實驗和臨床研究中均可降低尿蛋白、血糖、膽固醇和三酰甘油水平，其中動物實驗顯示，黃連素可降低腎臟指數、血肌酐水平及下調腎臟組織TLR4表達、上調腎臟組織PI3K和Nrf2表達。尿蛋白、腎臟指數、血肌酐、血糖、膽固醇、三酰甘油水平的降低，與下調腎臟組織TLR4表達和上調PI3K和Nrf2表達有關。動物實驗和臨床研究中血肌酐水平的結果不一致，可能與樣本量有關，也可能與動物模型組只用生理鹽水灌胃，臨床試驗對照組均有控制血糖藥物等基礎治療，高血糖對模型動物腎臟損害更大有關。黃連素能降低高脂飲食模型、非高脂飲食模型大鼠的膽固醇、三酰甘油水平，提示黃連素的降脂機制不僅僅是抑制飲食的吸收。研究發現，黃連素上調PI3K表達，下調TLR4表達，可見黃連素調控PI3K信號分子不依賴于TLR4［38］。敏感性分析可提高研究間的同質性，應用固定效應模型結果顯示，黃連素可降低血糖水平、腎臟指數、24 h尿蛋白、血肌酐水平。動物和臨床研究不良事件發生率低，成模率高、未見藥物不良反應報道，黃連素應用安全可靠。動物實驗漏斗圖示存在發表偏倚，臨床試驗只有3篇文獻未行漏斗圖檢測。

動物實驗和臨床研究質量均有一定的偏倚，動物實驗間異質性較大，臨床試驗數量少，這些均可能過高地估計了黃連素對DN的治療效果，望有更多高質量研究進一步評價黃連素的藥理作用。