光敏劑5-氨基酮戊酸聯合阿霉素對乳腺癌荷瘤裸鼠光動力作用及其機制的研究

祝寅 陳蘇杰

1江蘇省句容市人民醫院血液腫瘤科 212400；2江蘇省句容市人民醫院CT室 212400

乳腺癌是目前診斷最常見的癌癥，也是女性最致命的疾病之一［1］。乳腺癌的常規治療包括手術、放射、化療和糖皮質激素治療。然而，并不是所有乳腺癌患者都推薦手術治療，并且傳統的化療有多種不良反應，包括耐藥細胞的出現和毒性反應。因此，人們正在研究新的治療方法。光動力療法（photodynamic therapy，PDT）是一種新興的治療方式，早期PDT的研究中，發現局部乳腺癌是PDT的第一個靶點，隨后PDT 在胸壁轉移患者的研究中被證明有效［2-3］。光敏劑5-氨基酮戊酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）已被成功用于診斷和治療腫瘤。與其他類型的光敏劑相比，5-ALA 具有更高的腫瘤特異性和更少的光毒性［4］。PDT 常常與常規化療相結合［5］，通過納米技術形成多模式協同治療平臺。

本研究針對目前女性高發、病死率高的的乳腺癌，采用隨機對照實驗以裸鼠乳腺癌移植瘤為模型開展研究，使用5-ALA 聯合阿霉素（doxorubicin，DOX）進行治療，并對其作用機制進行初步探索，以期為臨床應用提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 資 料 2020 年10 月，選 取6 周 齡SPF 級 雌 性BALB/c-nu/nu 裸鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［許可證編號：SCXK（京）2019-0009］，體質量（20±2）g。5-ALA 和DOX 購 自 美 國Sigma-Aldrich（純 度 為HPLC≥98.0%），一抗表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α， HIF-1α） 、 3- 磷 酸 甘 油 醛 脫 氫 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗購自美國Cell Signaling。胎牛血清和RPMI-1640 細胞培養液購自南京生航生物技術有限公司。4T1 小鼠乳腺癌細胞購自寧波明舟生物科技有限公司。RIPA 裂解緩沖液、BCA 蛋白測定試劑盒、蘇木素伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒購自上海碧云天生物。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌小鼠模型的建立 BALB/c-nu/nu 裸鼠飼養在SPF 級實驗動物室的IVC 系統內，晝夜循環飼養12 h，溫度（20±2）℃，相對濕度（60±5）%。動物實驗按照動物研究倫理協議進行，在誘發乳腺癌之前，實驗小鼠經歷了1 周的新環境適應期。用含10%胎牛血清、鏈霉素（100 U/ml）和青霉素（100 U/ml）的RPMI-1640 培養基在37 ℃的CO2的培養箱中培養4T1 細胞，收集培養的細胞，懸浮于PBS 中，將含2×105個細胞0.2 ml 混合物注射到裸鼠背部皮下。注射后，監測小鼠潛在的腫瘤發展，并使用數字卡尺測量腫瘤的大小。當腫瘤長至約9 mm時，再將其分成4組。

1.2.2 動物分組及治療 將32 只荷瘤裸鼠分為4 組（每組8 只）：A 為空白對照組（不給任何治療）；B 為DOX 組（2 mg/kg DOX，每周1 次，共3 次）；C 為PDT 組（50 mg/kg 5-ALA+660 nm 激光照射，總照射劑量200 J/cm2，同時避光24 h，每周1 次，共3 次）；D 為聯合治療組（2 mg/kg DOX+50 mg/kg 5-ALA+660nm 激光照射）。化療藥物注射12 h后，腹腔注射5-ALA，12 h后進行激光照射，能量密度為200 J/cm2，照射時間為20 min。至治療后的第21 天，采用頸椎脫臼法處死裸鼠，腫瘤標本取出后先稱瘤重并計算抑瘤率，公式為：（1－治療組平均瘤重）/荷瘤組平均瘤重×100%，將一部分腫瘤組織置于福爾馬林液中固定以備免疫組化染色。在治療過程中，第一次治療前及治療后隔天測量所有裸鼠瘤徑。按照文獻方法 計 算 裸 鼠 瘤 體 積：V（cm3）=d2（cm2）×D（cm）/2［6］，其中d和D依次表示腫瘤的最短和最長徑。

1.3 腫瘤組織形態學觀察 腫瘤標本在4%多聚甲醛溶液中固定至少24 h 后，石蠟包埋，4 μm 厚切片，脫蠟后HE染色，光鏡下觀察。

1.4 Western blotting 檢測 用RIPA 裂解緩沖液提取腫瘤組織總蛋白，用BCA 檢測試劑盒測定總蛋白濃度。總蛋白（100 μg）經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移到PVDF 膜上。經5%脫脂牛奶封閉后，將膜與特異性一抗EGFR、HIF-1α 和GAPDH 在4 ℃下孵育過夜。隨后，將樣品與HRP 偶聯的二抗進行孵育，采用ECL 檢測系統進行灰度值分析。

1.5 統計學處理 所有實驗數據采用SPSS 22.0 進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以(±s)表示，采用方差分析，組間兩兩比較方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時使用Tamhane's 法，其中P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 5-ALA 聯合DOX 對乳腺癌荷瘤裸鼠體質量的影響 PDT 組 體 質 量 為（21.25±1.55）g，空 白 對 照 組 為（20.32±1.34）g、DOX 組為（18.16±1.10）g、聯合治療組為（17.93±1.21）g，DOX 組、聯合治療組分別與空白對照組及PDT 組相比，體質量均顯著下降（t=2.087、2.986、3.014、4.212，均P＜0.05），而PDT 組與空白對照組、DOX 組與聯合治療組的體質量比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.2 5-ALA 聯合DOX 對乳腺癌荷瘤裸鼠腫瘤體積及抑瘤率的影響 PDT 組腫瘤體積為（0.71±0.13）cm3、DOX 組為（0.65±0.19）cm3、空白對照組為（0.98±0.21）cm3，PDT 組、DOX 組分別與空白對照組比較，腫瘤體積均明顯縮小（t=5.729、4.388，均P＜0.05）；而聯合治療組腫瘤體積為（0.41±0.13）cm3，在所有組中最小，與其他組相比，差異均有統計學意義（t=10.884、8.769、6.182，均P＜0.05）。聯合治療組抑瘤率（58.20%，1.10/1.89）顯著高于PDT 組（27.51%，0.52/1.89）和DOX 組（33.86%，0.64/1.89）（t=8.521、8.867，均P＜0.05）。

2.3 5-ALA 聯合DOX 對乳腺癌荷瘤裸鼠病理結果的影響 HE 染色顯示空白對照組腫瘤細胞致密，結構完整。其余各組細胞凋亡和壞死明顯增多，凋亡細胞縮小，胞漿濃縮，其中聯合治療組細胞凋亡和壞死最嚴重。

2.4 5-ALA 聯合DOX 對乳腺癌荷瘤裸鼠EGFR 和HIF-1α 蛋白表達的影響 研究結果表明，PDT 組和聯合治療組與空白對照組和DOX 組相比，EGFR 和HIF-1α 蛋白表達均顯著下降（t=2.354、3.287、4.239、5.894，均P＜0.05）。見圖1。

圖1 5-ALA聯合DOX對乳腺癌荷瘤裸鼠EGFR（A）和HIF-1α（B）蛋白表達的影響

3 討 論

現有的乳腺癌臨床治療方法不良反應大、預后差，迫切需要新的有效治療乳腺癌的方法。PDT 是一種很有前途的微創治療方法，自20世紀90年代以來被廣泛應用于各種腫瘤的治療［7］。PDT 與傳統放療或化療的優勢變得越來越明顯，包括部位特異性、克服腫瘤對其他療法的耐藥性及不良反應很少。本研究結果也顯示，PDT 組與空白對照組相比，體質量差異無統計學意義，雖然聯合治療組與空白對照組、PDT相比，體質量均顯著下降，但其與DOX組之間的體質量比較差異無統計學意義，表明了PDT 治療具有不良反應小的優點。

PDT 的治療優勢在于它能夠靶向乳腺腫瘤，并將對其他正常組織的損害降至最低，它還與化療有協同抗癌作用。本研究顯示聯合治療組小鼠的腫瘤體積最小、抑瘤率最高，且病理結果發現聯合治療組與其他組相比，細胞凋亡和壞死最嚴重，表明PDT聯合化療治療乳腺癌具有較好的療效，兩者聯用具有協同增效的作用。

EGFR是一種酪氨酸激酶受體，在許多類型的實體腫瘤中被認為是癌基因，30%的乳腺癌過度表達EGFR，這種過度表達與不良預后相關［8］。而缺氧或低氧濃度是導致腫瘤進展的另一個因素，HIF-1α 激活血管生成［9］，并抑制凋亡［10］。因此，缺氧腫瘤往往與不良的預后相關。本研究發現PDT可以抑制腫瘤組織EGFR和HIF-1α蛋白的表達。

綜上所述，本研究發現PDT 聯合DOX 治療乳腺癌具有療效好、不良反應小的優點，機制可能與PDT 抑制EGFR 和HIF-1α蛋白表達有關。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。