線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白Drp1在大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙中的作用

朱國(guó)松 唐富東 王開偉

【摘要】目的 探討線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1（Drp1）在大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙中的作用。方法 采用隨機(jī)數(shù)表法將64只健康清潔級(jí)成年雄性SD大鼠分為生理鹽水對(duì)照組（C組）、Drp1選擇性抑制劑Mdivi-1腹腔注射組（M組）、手術(shù)組（O組）和Mdivi-1腹腔注射+手術(shù)組（MO組）。M組和MO組腹腔注射Mdivi-1（50 mg/kg）0.5 mL，C組和O組腹腔注射0.5 mL生理鹽水。分別于術(shù)前、術(shù)后第1日和術(shù)后第3日進(jìn)行水迷宮測(cè)試，觀察大鼠的游泳距離和逃避潛伏期。術(shù)后24 h處死大鼠，取海馬組織，檢測(cè)其中三磷酸腺苷（ATP）含量，用透射電鏡觀察線粒體分裂情況，用蛋白免疫印跡法檢查線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I和V的表達(dá)。結(jié)果 與C組比較，O組線粒體過度分裂，線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I和V水平下降，ATP含量減少，O組術(shù)后第1日和第3日逃避潛伏期及游泳距離延長(zhǎng)（P均< 0.05）。與O組比較，MO組線粒體分裂減少，線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I和V水平升高，ATP含量增多;O組術(shù)后第1日和第3日逃避潛伏期及游泳距離縮短（P均< 0.05）。結(jié)論 線粒體Drp1介導(dǎo)的線粒體過度分裂參與了術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生過程。

【關(guān)鍵詞】線粒體;動(dòng)力相關(guān)蛋白1;Mdivi-1;術(shù)后認(rèn)知功能障礙

The role of mitochondrial dynamin-related protein 1 in postoperative? cognitive dysfunction in rat models Zhu Guosong， Tang Fudong， Wang Kaiwei. Department? of Anesthesiology and Perioperative Medicine， Henan Provincial Peoples Hospital，? Zhengzhou 450000， China

Corresponding author，Wang Kaiwei， E-mail： wangkw1975@163.com

【Abstract】Objective To investigate the role of mitochondrial dynamin-related protein 1 （Drp1） in postoperative cognitive dysfunction in rat models. Methods 64 healthy male Spragne-Dawley rats were randomly divided into the normal saline control group （group C）， Drp1 selective inhibitor Mdivi-1 intraperitoneal injection group （group M）， operation group （group O）， and Mdivi-1 intraperitoneal injection plus operation group （group MO） by using the random number table method. Mdivi-1 （50 mg/kg， 0.5 mL） was given via intraperitoneal injection in the M and MO groups. Normal saline（0.5 mL）was given in the C and O groups. Morris water maze test （MWN） was performed before operation， and 1 d and 3 d after operation. The escape latency and swimming distance were recorded. The animals were sacrificed at 24 h after operation. Hippocampal tissues were obtained for determination of ATP content. The mitochondrial division was observed by transmission electron microscopy. The expression levels of mitochondrial electron transport chain complex I and V were quantitatively measured by Western blot. Results Compared with the group C， mitochondrial division was significantly increased， and the expression levels of mitochondrial electron transport chain complex I and V were significantly down-regulated， the ATP content was significantly decreased， and the escape latency and swimming distance were significantly prolonged at postoperative 1 and 3 d in the group O （all P < 0.05）. Compared with the group O， mitochondrial division was significantly decreased， the expression levels of mitochondrial electron transport chain complex I and V were significantly up-regulated and the ATP content was significantly increased， the escape latency and swimming distance were significantly shortened at 1 and 3 d after operation in group MO （all P < 0.05）. Conclusion Excessive mitochondrial division mediated by Drp1 is involved in the pathogenesis of postoperative cognitive dysfunction.

【Key words】Mitochondrion; Dynamin-related protein 1; Mdivi-1;

Postoperative cognitive dysfunction

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（POCD）是一種術(shù)后比較常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，在大、中型非心臟手術(shù)中，65歲以上患者的POCD發(fā)生率高達(dá)40%，在心臟手術(shù)中，該比例可高達(dá)60%，嚴(yán)重影響患者預(yù)后，因此探討其發(fā)病機(jī)制意義重大[1-2]。研究表明能量代謝異常是引起認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵因素之一，線粒體融合分裂失衡是線粒體功能損傷的標(biāo)志性事件[3]。線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1（Drp1）是維持線粒體融合分裂平衡的重要因素。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用Drp1抑制劑抑制線粒體的過度分裂，維持線粒體的正常功能，能夠治療腦卒中、心肌梗死和神經(jīng)退行性疾病。海馬是與認(rèn)知功能密切相關(guān)的腦區(qū)，海馬組織中線粒體Drp1在POCD中的作用尚不明確。本研究擬探討線粒體Drp1在大鼠POCD中的作用。

材料與方法

一、動(dòng)物選擇及分組

健康清潔級(jí)成年雄性SD大鼠64只（購于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），18 ～ 20月齡，體質(zhì)量460 ～

500 g，分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，環(huán)境溫度控制于21 ～ 23℃。采用隨機(jī)數(shù)表法將其分為生理鹽水對(duì)照組（C組）、Drp1選擇性抑制劑Mdivi-1（mitochondrial division inhibitor 1）腹腔注射組（M組）、手術(shù)組（O組）和Mdivi-1腹腔注射+手術(shù)組（MO組），每組16只。

二、POCD動(dòng)物模型建立

采用2.5%異氟醚作麻醉誘導(dǎo)，待大鼠翻正反射消失后將其仰臥固定于手術(shù)板上，再持續(xù)吸入2%異氟醚維持麻醉深度。在無菌條件下，行腹部正中切口約1 cm，打開腹腔，用食指刺激腹腔肌肉和內(nèi)臟，然后取出約10 cm小腸用手指摩擦30 s。

在整個(gè)手術(shù)過程中使用保溫毯加熱，維持大鼠體溫于36.5 ～ 37.0℃。手術(shù)結(jié)束后嚴(yán)格無菌操作，逐層關(guān)閉大鼠腹腔。手術(shù)持續(xù)時(shí)間約為15 min[4]。C組和M組無接受麻醉及手術(shù)。手術(shù)結(jié)束后，C組和O組立即腹腔注射0.5 mL生理鹽水，M組和MO組立即腹腔注射Mdivi-1（50 mg/kg）0.5 mL。為排除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力的改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，采用BBB評(píng)分判斷大鼠術(shù)前術(shù)后的運(yùn)動(dòng)能力。本研究經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：HNSRMYY2019-002）。

三、檢測(cè)指標(biāo)

1. Morris水迷宮測(cè)試

每組隨機(jī)取8只大鼠于術(shù)前連續(xù)測(cè)試3 d，每日訓(xùn)練6次，以第15次測(cè)試的成績(jī)作為術(shù)前成績(jī)。各組大鼠休息1 d后接受相應(yīng)處理。于術(shù)后第1日和第3日的相同時(shí)間點(diǎn)行Morris水迷宮測(cè)試，以檢測(cè)大鼠的行為學(xué)，包括逃避潛伏期時(shí)間和游泳距離[5]。

2. 電鏡觀察線粒體

術(shù)后24 h處死每組剩余的未進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)的8只大鼠，取其海馬組織固定，在0 ～ 4℃下操作，使用戊二醛固定液固定組織，經(jīng)過充分洗滌后，應(yīng)用鋨酸固定，2次固定的時(shí)間均為20 min;按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行脫水，組織包埋，超薄切片機(jī)切片，電子染色，透射電子顯微鏡觀察結(jié)果。

3. 三磷酸腺苷（ATP）含量檢測(cè)

應(yīng)用ATP檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測(cè)大鼠海馬組織中ATP水平。按照試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)流程，準(zhǔn)確稱量海馬組織質(zhì)量，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，制備ATP檢測(cè)工作液，測(cè)定ATP濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中ATP的濃度，并測(cè)定蛋白濃度以消除樣品制備時(shí)造成的誤差。總ATP水平表示為nmol/mg蛋白。

4. 蛋白免疫印跡法檢測(cè)線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ（ComplexⅠCOQ9）和Ⅴ（Complex? ⅣATP5F1）的表達(dá)

研磨海馬組織，使用全蛋白提取試劑盒（南京凱基公司）提取蛋白，進(jìn)行定量。蛋白定量后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，分別加入一抗大鼠抗COQ9（美國(guó)Santa Cruz公司），一抗大鼠抗ATP5F1（美國(guó)Santa Cruz公司）和大鼠抗β-actin于4℃搖動(dòng)孵育過夜，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃孵育120 min，按照ECL發(fā)光試劑盒的操作步驟，在暗室中進(jìn)行曝光、顯影以及定影。采用AIC.AlphaView軟件對(duì)蛋白免疫印跡圖片進(jìn)行灰度分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性，Levene檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)方差齊性，其中正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析。析因設(shè)計(jì)資料使用析因設(shè)計(jì)方差分析，交互效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，采用LSD-t檢驗(yàn)分析單獨(dú)效應(yīng)。α = 0.05。

結(jié)果

一、Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)手術(shù)操作簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷小，各組大鼠術(shù)前、術(shù)后第1日、第3日的BBB評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），說明大鼠的運(yùn)動(dòng)能力無明顯變化。Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果顯示，各組術(shù)前逃避潛伏期和游泳距離比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）。術(shù)后第1日和術(shù)后第3日行析因設(shè)計(jì)方差分析表明， Mdivi-1與手術(shù)處理間的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（逃避潛伏期術(shù)后第1日：F = 96.26、P < 0.001，術(shù)后第3日：F = 82.95、P < 0.001;游泳距離術(shù)后第1日：F = 66.56、P < 0.001，術(shù)后第3日：F = 63.45，P < 0.001），估算邊際平均值見圖1、2。與C組相比，O組大鼠術(shù)后第1日和第3日逃避潛伏期及游泳距離延長(zhǎng);與O組相比，MO組大鼠術(shù)后第1日和第3日的逃避潛伏期及游泳距離縮短（P均< 0.05），見表1、2。

二、電鏡下線粒體的變化

與C組比較，O組線粒體分裂嚴(yán)重，多數(shù)線粒體體積較小，線粒體嵴模糊不清，線粒體內(nèi)空泡較多。C組與M組線粒體分裂差別不大。與O組比較，MO組線粒體分裂明顯減少，形態(tài)較一致，線粒體嵴較規(guī)則，線粒體內(nèi)空泡明顯減少，見圖3。

三、線粒體ComplexⅠCOQ9和Complex ⅣATP5F1的表達(dá)水平

析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果表明， Mdivi-1與手術(shù)處理間的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ComplexⅠ COQ9：F = 71.18、P < 0.001，ComplexⅣATP5F1：F = 58.93、P < 0.001，ATP：F = 84.36、P < 0.001），估算邊際平均值見圖5。與C組相比，O組大鼠線粒體ComplexⅠCOQ9和ComplexⅣATP5F1的表達(dá)水平降低，ATP含量減少;與O組相比，MO組大鼠線粒體ComplexⅠCOQ9和ComplexⅣ ATP5F1的表達(dá)水平升高，ATP含量增多（P均< 0.05），見表3和圖4、5。

討論

本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)，通過吸入麻醉聯(lián)合剖腹探查術(shù)構(gòu)建大鼠POCD模型[4]。Morris水迷宮測(cè)試主要用于海馬和外海馬的研究，以及測(cè)試動(dòng)物對(duì)方向覺（空間定位）和空間位置覺的學(xué)習(xí)記憶能力。本研究結(jié)果表明，與C組比較，O組大鼠逃避潛伏期及游泳距離延長(zhǎng)，說明術(shù)后POCD模型制備成功。

線粒體是一種不斷分裂和融合的動(dòng)態(tài)變化的細(xì)胞器，這種動(dòng)態(tài)變化被稱之為線粒體動(dòng)力學(xué)。正常情況下，線粒體分裂和融合保持動(dòng)態(tài)平衡，以此維持線粒體形態(tài)、分布和功能的正常。多種因素包括手術(shù)、麻醉藥物、氧化應(yīng)激和缺血再灌注等均能導(dǎo)致線粒體分裂和融合失衡，主要表現(xiàn)為線粒體分離增強(qiáng)，融合抑制，致使線粒體動(dòng)力學(xué)失衡和功能障礙。研究者發(fā)現(xiàn)軸索和樹突內(nèi)線粒體的缺乏直接或間接地影響飛蠅突觸功能，而樹突分支減少和樹突棘的病理改變與認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)[6]。已證實(shí)線粒體功能異常是全身麻醉藥物引起神經(jīng)元毒性、神經(jīng)功能異常的中心環(huán)節(jié);海馬神經(jīng)元線粒體途徑凋亡參與了老齡大鼠POCD的形成[7-10]。神經(jīng)功能紊亂的患者線粒體功能障礙要早于病理損傷，線粒體動(dòng)力學(xué)失衡是神經(jīng)元凋亡的早期表現(xiàn)[11]。本研究結(jié)果顯示，O組大鼠線粒體過度分裂，線粒體分裂融合失衡，線粒體功能受損，提示線粒體功能異常可誘發(fā)或者加重大鼠POCD。

線粒體Drp1、線粒體分裂蛋白和線粒體分裂因子等參與了線粒體的分裂，而其中起主要作用的是Drp1。Mdivi-1為可以穿過細(xì)胞膜的喹唑酮類衍生物，是Drp1的選擇性抑制劑，Mdivi-1作用于線粒體分裂中Drp1的聚集過程，從而抑制Drp1誘發(fā)的線粒體分裂及細(xì)胞凋亡。Mdivi-1抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，故具有抗凋亡作用。Mdivi-1還可減輕氧化應(yīng)激損傷及肺部炎癥反應(yīng)。最新的研究表明Mdivi-1能顯著減輕心肌缺血再灌注損傷，提高心臟驟停小鼠的生存率和減少急性腎損傷中的細(xì)胞凋亡。Mdivi-1通過抑制Drp1蛋白發(fā)揮對(duì)大鼠大腦缺血性損傷的保護(hù)作用[12-14]。Mdivi-1可明顯改善缺血再灌注損傷海馬神經(jīng)元ATP酶活性及ATP含量，提高能量代謝[15]。本研究中O組與MO組的結(jié)果比較提示了通過抑制Drp1介導(dǎo)線粒體過度分裂，可減輕大鼠POCD，故Mdivi-1有望成為治療POCD新藥。

本研究存在一定的局限性：①尚未能確定線粒體融合機(jī)制在POCD中的作用;②本研究?jī)H僅觀察了術(shù)后第1日和第3日的情況，線粒體在POCD中的長(zhǎng)期作用還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，Drp1介導(dǎo)的線粒體過度分裂參與了POCD的發(fā)生過程。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-04-02）

（本文編輯：洪悅民）