絞股藍提取物通過調控lncRNA PICSAR對IL-1β誘導軟骨細胞損傷的保護作用及機制研究

劉文斌，李艷兵，周焱濤

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種隨著年齡增長發病率逐漸增加的慢性關節疾病，其發病機制復雜，涉及氧化應激、軟骨細胞凋亡、細胞外基質降解及滑膜炎性反應等[1-4]。近年來發現中醫藥治療骨關節炎療效確切，能夠多靶點、多途徑發揮治療作用[5-6]。因此，開發可用于治療骨關節炎的中藥對改善患者生活質量具有重要意義。絞股藍為絞股藍屬植物的全草，其含有多種無機元素等，研究報道絞股藍皂苷提取物對痛風性關節炎相關的炎性疼痛發揮鎮痛作用[7]。絞股藍總苷顆粒可通過清除活性氧(reactive oxygen species，ROS)減輕大鼠膠原誘導性關節炎的癥狀。絞股藍皂苷抑制白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)誘導的人骨關節炎軟骨細胞炎性反應[8]。然而絞股藍提取物對IL-1β誘導軟骨細胞損傷的影響及機制尚不清楚。研究發現長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在包括關節炎在內的各種自身免疫性疾病中起著關鍵作用[9]。研究報道lncRNA PICSAR在類風濕關節炎滑液中的表達明顯升高，通過刺激miR-4701-5p促進成纖維樣滑膜細胞的增殖、遷移和侵襲，進而造成關節破壞[10]。說明lncRNA PICSAR可影響關節炎的發生發展。然而lncRNA PICSAR對IL-1β誘導軟骨細胞損傷的影響，及絞股藍提取物是否調控lncRNA PICSAR也尚不清楚。因此，本實驗旨在研究絞股藍提取物對IL-1β誘導軟骨細胞損傷的影響及機制是否與lncRNA PICSAR有關，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細胞：人關節軟骨細胞購自美國sciencell公司；(2)試藥試劑：絞股藍提取物(純度>98%)購自南京道斯夫生物科技有限公司；DMEM培養基購自上海中喬新舟生物科技有限公司； IL-1β購自上海烜雅生物科技有限公司；細胞計數試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8)購自北京泰澤嘉業科技發展有限公司；凋亡檢測試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自美國Invent公司；丙二醛(malonaldehyde，MDA)水平檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司；(3)儀器設備：Multiskan FC酶標儀購自美國Thermo公司；FACS caliber流式細胞儀購自美國BD公司；VCX750超聲波細胞破碎儀購自美國Sonics公司。

1.2 實驗方法 2020年10月—2021年4月于湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫院進行實驗。(1)軟骨細胞用DMEM培養基在37℃的孵育箱中培養，取對數生長期細胞，正常培養的細胞作為對照(NC)組；用10 ng/ml的IL-1β作用軟骨細胞(誘導軟骨細胞模擬其損傷)作為IL-1β組，分別用濃度為5、10、20 μg/ml的絞股藍提取物和10 ng/ml的IL-1β處理軟骨細胞，記為絞股藍提取物低、中、高劑量組；(2)將PICSAR抑制表達質粒及陰性對照轉染至軟骨細胞6 h后，用10 ng/ml的IL-1β處理24 h，記為IL-1β+si-lncRNA PICSAR組、IL-1β+si-con組，研究抑制lncRNA PICSAR對軟骨細胞損傷的影響；將PICSAR過表達質粒及陰性對照轉染至軟骨細胞后6 h后，用20 μg /ml的絞股藍提取物和10 ng/ml的IL-1β處理24 h，記為pcDNA-lncRNA PICSAR+高劑量組、pcDNA-con+高劑量組，研究絞股藍提取物和lncRNA PICSAR對軟骨細胞損傷的影響。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 CCK-8法檢測細胞活力：各組處理軟骨細胞以2×103個/孔的密度接種在96孔板中，培養24 h，將10 μl的CCK-8溶液添加到每孔中，酶標儀檢測各組細胞450 nm處的吸光度值(A)。

1.3.2 流式細胞術檢測細胞凋亡：收集各組處理軟骨細胞，用預冷的PBS漂洗2次，加入結合緩沖液(1×Binding Buffer)400 μl重懸，然后加入10 μl的Annexin V-FITC和PI混勻，避光孵育10 min；以流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.3 蛋白質印跡(Western-blot)法檢測凋亡相關蛋白Cleave-caspase-3的表達：提取各組軟骨細胞的總蛋白，定量后通過凝膠電泳分離蛋白，然后轉至聚偏二氟乙烯膜上，封閉后加入裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleave-caspase-3)多克隆抗體(1∶800)，4℃孵育過夜，加入山羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)室溫孵育2 h，ECL發光液顯影，成像后用Quantity One分析蛋白條帶的灰度值，以Cleave-caspase-3/β-actin條帶的比值作為蛋白相對表達水平。

1.3.4 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測氧化應激性指標MDA水平和SOD、CAT活性：收集各組培養48 h的細胞，超聲10 min使細胞裂解，2 000 r/min離心20 min取上清，各項指標均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測lncRNA PICSAR表達水平：提取各組細胞的總RNA，反轉錄成cDNA后以GAPDH為內參進行PCR擴增，循環條件為95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環；lncRNA PICSAR上游引物序列：5'-GCTGAACTGCCTGGACTTTC-3'，下游引物序列：5'-GTCTGAGGAAGAGGCACCTG-3'；GAPDH上游引物序列：5'-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3'，下游引物序列：5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3'。相對表達量采用2-△△Ct法計算各組lncRNA PICSAR表達水平。

2 結 果

2.1 不同濃度絞股藍提取物對IL-1β誘導的OA軟骨細胞活力及細胞凋亡的影響 與NC組比較，IL-1β組軟骨細胞活力降低、凋亡率升高，Cleave-caspase-3表達水平升高(P<0.05)；與IL-1β組比較，絞股藍提取物低、中、高劑量組軟骨細胞活力依次升高、凋亡率依次降低，Cleave-caspase-3表達水平依次降低(P均<0.05)，見圖1、表1 。

圖1 不同濃度絞股藍提取物對OA軟骨細胞Cleave-caspase-3蛋白表達的影響

表1 不同濃度絞股藍提取物對IL-1β誘導的OA軟骨細胞活力及細胞凋亡影響的比較

2.2 不同濃度絞股藍提取物對IL-1β誘導的OA軟骨細胞氧化應激影響的比較 與NC組比較，IL-1β組軟骨細胞中MDA水平升高，SOD和CAT活性降低(P<0.05)；與IL-1β組比較，絞股藍提取物低、中、高劑量組軟骨細胞中MDA水平依次降低，SOD和CAT活性依次升高(P均<0.05)，見表2。

表2 不同濃度絞股藍提取物對IL-1β誘導的OA軟骨細胞氧化應激影響的比較

2.3 不同濃度絞股藍提取物對lncRNA PICSAR表達比較 與NC組比較，IL-1β組軟骨細胞中lncRNA PICSAR表達水平升高(1.00±0.10 vs. 2.68±0.17，P<0.05)；與IL-1β組比較，絞股藍提取物低、中、高劑量組軟骨細胞中lncRNA PICSAR表達水平依次降低(2.17±0.15、1.68±0.12、1.21±0.09),差異有統計學意義(F=254.805，P=0.000)。

2.4 抑制lncRNA PICSAR對IL-1β誘導的OA軟骨細胞活力、細胞凋亡及氧化應激的影響比較 與IL-1β+si-con組比較，IL-1β+si-lncRNA PICSAR組lncRNA PICSAR表達水平、Cleave-caspase-3表達水平、細胞凋亡率、MDA水平均降低，軟骨細胞活力及SOD、CAT活性均升高(P<0.01)，見圖2，表3。

表3 抑制lncRNA PICSAR對IL-1β誘導的OA軟骨細胞活力、細胞凋亡及氧化應激的影響

注：A.IL-1β+si-con組；B.IL-1β+si-lncRNA PICSAR組；Cleave-caspase-3.裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

2.5 lncRNA PICSAR過表達在絞股藍提取物對IL-1β誘導的OA軟骨細胞活力、細胞凋亡及氧化應激中的影響 與pcDNA-con+高劑量組比較，pcDNA-lncRNA PICSAR+高劑量組lncRNA PICSAR表達水平、Cleave-caspase-3表達水平、細胞凋亡率、MDA水平升高，軟骨細胞活力及SOD、CAT活性均降低(P<0.05)，見圖3、表4。

表4 過表達lncRNA PICSAR在絞股藍提取物對IL-1β誘導的OA軟骨細胞活力、細胞凋亡及氧化應激的影響

注：A.pcDNA-con+高劑量組；B.pcDNA-lncRNA PICSAR+高劑量組；Cleave-caspase-3.裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

3 討 論

骨關節炎是一種以關節軟骨進行性退化為特征的骨關節疾病，軟骨細胞是關節軟骨中的唯一細胞，軟骨細胞凋亡可直接導致關節軟骨退變甚至鈣化，影響關節功能[11-12]。研究表明氧化應激參與了骨關節炎的病理過程，氧化應激可促使軟骨細胞凋亡甚至導致病理損傷[13-15]。本實驗用IL-1β誘導軟骨細胞模擬其損傷情況，結果顯示，軟骨細胞活力降低，凋亡率升高，MDA水平升高，SOD和CAT活性降低；表明IL-1β誘導了軟骨細胞凋亡和氧化應激的產生。研究報道絞股藍皂苷對過氧化氫誘導的成骨細胞氧化應激損傷具有一定的保護作用，并對損傷的成骨細胞有促進增殖分化的作用[16-17]。絞股藍總苷通過提高血管內皮細胞抗氧化活性對血管內皮細胞損傷起保護作用[18]。絞股藍皂苷通過同時抑制神經元氧化應激和炎性反應來預防過氧化氫誘導的視網膜神經節細胞凋亡[19]。以上研究表明，絞股藍的有效成分皂苷具有抗氧化作用。為研究絞股藍提取物對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷是否有影響，本實驗用不同劑量絞股藍提取物處理IL-1β誘導的軟骨細胞，結果顯示，軟骨細胞活力升高，凋亡率降低，Cleave-caspase-3表達水平降低，MDA水平降低，SOD和CAT活性升高。Cleave-caspase-3是凋亡相關蛋白，其表達水平升高表明細胞凋亡增多，因此，本實驗結果表明絞股藍提取物可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡和氧化應激。

研究表明，lncRNA參與調控骨關節炎軟骨細胞損傷[20]。研究報道，lncRNA MALAT1通過調節miR-150-5p/AKT3軸促進軟骨細胞增殖，抑制細胞凋亡和細胞外基質降解[21]。lncRNA NR024118過表達可抑制脂多糖誘導的軟骨細胞凋亡、氧化應激和炎性反應[22]。而lncRNA PICSAR對IL-1β誘導的軟骨細胞的影響尚不清楚。本結果顯示，IL-1β誘導的軟骨細胞中lncRNA PICSAR表達水平升高，提示lncRNA PICSAR可能參與軟骨細胞損傷過程。進一步抑制lncRNA PICSAR表達后，軟骨細胞活力升高，Cleave-caspase-3表達水平降低，細胞凋亡率降低，MDA水平降低，SOD和CAT活性升高；表明抑制lncRNA PICSAR表達可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡和氧化應激。過表達lncRNA PICSAR能夠逆轉絞股藍提取物對IL-1β誘導的軟骨細胞活力、細胞凋亡及氧化應激的影響。

綜上，絞股藍提取物通過下調lncRNA PICSAR抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡和氧化應激，減輕IL-1β誘導的軟骨細胞損傷。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉文斌: 設計研究方案，課題設計，實施研究過程，論文撰寫;李艷兵:提出研究思路，分析試驗數據，論文審核;周焱濤:實施研究過程，資料搜集整理，論文修改，進行統計學分析