基于基因表達數據庫分析EZH2基因在乳腺癌中的表達及其臨床意義

張寶貴 (天津市靜海區醫院普外科，天津 301600)

乳腺癌(breast cancer)在女性發病率為第一位，新進的流行病學研究顯示，2019年全美預計乳腺癌新發病例271 270例，當年因乳腺癌死亡人數為42 260例[1]。乳腺癌已成為導致女性死亡的重要原因。我國腫瘤流行病數據顯示2015年乳腺癌新發病例272 400，死亡人數為707 000例[2]。從數據中可以看出，我國乳腺癌患者預后差于歐美等發達國家。

Zeste同源物2增強子EZH2基因定位于人7染色體q36.1，全長為7 693 bp，編碼蛋白為多梳蛋白復合體PcG (Polycomb group)家族重要成員之一[3]。EZH2編碼蛋白為賴氨酸N-甲基轉移酶(酶代碼EC2.1.1.43)，參與組蛋白甲基化，為重要的基因表達調控因子。在本研究中，筆者通過多個數據庫對乳腺癌EZH2基因表達的臨床意義進行了分析，探討EZH2表達與患者預后的關系，并分析了其共表達蛋白網絡，為EZH2靶向調控乳腺癌的生物學功能及臨床靶向藥物研發提供依據。

1 資料與方法

1.1數據庫選擇：分別選擇腫瘤基因表達芯片數據庫Oncomie(https://www.oncomine.org/),生存分析數據庫Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)和蛋白-蛋白相互作用String數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)對EZH2基因表達情況及其臨床意義進行分析。

1.2Oncomine，Kaplan-Meier Plotter和String數據庫挖掘

1.2.1Oncomine數據庫分析：首先對Oncomie數據庫EZH2基因檢索，初步評估EZH2基因mRNA在多種腫瘤組織中的表達情況(高表達或低表達)，然后選擇乳腺癌進行數據挖掘。數據挖掘條件為：①腫瘤類型：乳腺癌；②標本類型：手術切除標本；③組織對比：乳腺癌vs 正常乳腺組織；④數據類型：mRNA；⑤顯著性：P<1E-4；⑥差異表達級別：大于2倍；⑦基因排序：前10%。

1.2.2Kaplan-Meier Plotter數據庫生存分析：檢索該數據庫中乳腺癌EZH2 mRNA預后數據，選擇總生存期和無疾病進展生存期進行分析。根據EZH2 mRNA中位表達水平分為高表達和低表達組，進行比較。繪制生存曲線，計算中位生存時間及生存風險比(HR)和95%置信區間(95%CI)。

1.2.3String 數據庫蛋白相互作用分析：在該數據庫中，對EZH2蛋白相關的蛋白網絡進行分析，篩選條件為相關性大于0.9。同時進行共表達分析，繪制共表達和相關網絡圖。

2 結果

2.1EZH2基因mRNA在腫瘤與正常組織差異表達：EZH2基因mRNA在腫瘤組織與對應正常組織中的研究共449項，其中存在差異的研究74項，68項研究EZH2 mRNA在腫瘤組織中表達上調，6項研究下調。在乳腺癌中，上調表達的有8項，見圖1。

圖1 EZH2 基因mRNA在多種實體腫瘤與對應正常組織中的整體表達

2.2EZH2 mRNA在乳腺癌與正常乳腺組織中的差異表達：Oncomine數據庫中，有三項基因表達芯片數據關于EZH2在乳腺癌與正常組織中的差異表達分析，其中一項來自TCGA數據庫(http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)，另兩項來自已發表文獻[4-5]。三項基因芯片結果包含了11個數據系列，分別對比了不同乳腺癌病理組織類型于對應的正常乳腺組織EZH2 mRNA表達結果，11個數據系列的薈萃分析顯示，EZH2 mRNA在乳腺癌組織中的表達水平顯著高于正常組織(P<0.05)。

2.3EZH2 mRNA表達水平與乳腺癌患者生存期：應用Kaplan-Meier Plotter數據庫中乳腺癌EZH2基因表達譜芯片數據分析EZH2高低表達于乳腺癌患者預后的相關性。結果顯示EZH2高低表達組總生存期分別為79.2個月和120.0個月，差異有統計學意義(HR=1.31 95%CI:1.05～1.62,P<0.05)，而高低表達組無疾病進展生存期分別為34.8個月和74.0個月，差異有統計學意義(HR=1.49,95%CI:1.34～1.67,P<0.05)。見圖2。

2.4EZH2相互作用蛋白網絡：在String數據庫中分析EZH2相互作用的蛋白，富集條件為p=2E-15，節點數共11個。見圖3。作用評分均大于0.9。上述相互作用蛋白大多為多梳蛋白家族，大多與組蛋白修飾有關。共表達分析顯示EZH2蛋白于SUZ12,EED，AEBP2等蛋白具有共表達關系。

圖3 EZH2基與表達蛋相關蛋白-蛋白相互作用網絡圖

3 討論

EZH2蛋白為多梳蛋白復合體家族重要成員之一，該蛋白具有甲基化活性可促進異染色質的形成，從而沉默基因功能。在細胞有絲分裂過程中，EZH2也需要重塑染色體異染色質[6-7]。EZH2蛋白是組蛋白甲基化重要的工具酶，能夠催化H3K27(組蛋白H3賴氨酸27位)甲基化，促進多個癌基因的表達[8]。EZH2是多梳抑制復合物2(prc2)的催化亞單位。EZH2的催化活性取決于它與suz12和eed形成的復合物。作為多梳抑制復合物2的一部分EZH2蛋白可催化組蛋白h3k27(h3k27me3)的三甲基化，從而導致調控基因表達[9-11]。

(A:總生存比較；B:無疾病進展生存比較)圖2 EZH2 mRNA表達水平與乳腺癌患者預后關系生存曲線

已有研究認為與正常組織比較，EZH2在多種腫瘤組織中呈現明顯的高表達，如乳腺癌[12]、胃癌[13-14]、肺癌等[15-16]，并與患者的臨床病理特征如腫瘤分期、病理分級、淋巴結轉移等存在潛在的相關性。沙聰等人采用EZH2在免疫組化方法探討EZH2蛋白表達與乳腺癌患者臨床特征和預后的關系。研究顯示乳腺癌組織中EZH2陽性表達與腫瘤大小，差異有統計學意義(P<0.05)和淋巴結轉移(P<0.05)有關，且EZH2陽性表達患者遠期生存率低于陰性乳腺癌患者[17]。

應用免疫組化技術雖然可以在一定程度上分析EZH2表達與患者的預后關系。但免疫組化為半定量分析，其操作相對復雜，受到影響的因素較多。同時，該方法大多用于單個樣本檢測，無法實現高通量快速檢測。隨著表達譜芯片和二代測序技術的成熟，基因表達高通量分析成為篩選腫瘤患者預后因素和靶向藥物的重要手段[18]。在本研究中，筆者綜合分析了多個生物信息數據庫，并對乳腺癌中EZH2的表達情況及其與患者的預后進行了分析。結果認為與正常的乳腺組織相比，乳腺癌組織中EZH2 mRNA表達水平明顯上調，并與患者生存時間較短有關，與既往文獻報道基本一致。EZH2蛋白與SUZ12,EED，AEBP2蛋白相互作用并呈現共表達趨勢。EZH2蛋白與SUZ12,EED，AEBP2多為參與組蛋白修飾的因子，其協同表達共同參與組蛋白生物學功能，進而對相關基因的表達起到重要的調控作用。