砂仁復方對5-FU所致大鼠腸道菌群調節作用研究*

李 菊，趙榮華，陳 鑫，何玉瀟，牛璐璐，孫瑞芬

（云南中醫藥大學，云南 昆明 650500）

惡性腫瘤嚴重威脅著全球公眾的生命健康，是全世界亟待解決的健康問題，在我國腫瘤死亡占全部死因的1/4[1]。腫瘤控制已經成為世界各國政府的衛生戰略重點[2]。腫瘤治療最主要的手段為手術及放化療，而化療藥物的長期使用會產生一系列的毒副反應，影響患者生存質量甚至危及患者生命[3-5]。而胃腸道反應是化療后主要不良反應之一，除了常見的惡心、嘔吐等癥狀外，化療藥物能引起腹脹、腹瀉、食欲減退、便秘，并能直接殺傷腸腔正常菌群，破壞腸道菌群穩態[6-8]。如何緩解化療患者胃腸反應，并保持腸道菌群的平衡，成為了腫瘤化療能否耐受的關鍵環節。

中醫治療胃腸道疾病具有較好的療效[9]。砂仁復方以砂仁為主，輔以人參、滇黃精制成。砂仁為豆蔻屬多年生草本植物，在臨床上具有保護胃粘膜、改善胃腸機能、止痛、止瀉、促進消化液的分泌、調節腸道微生物菌群等作用[10-12]。人參具有大補元氣，復脈固脫，補脾益肺，生津止渴，安神益智的功效[13]。現代藥理學研究證明人參具有提高機體免疫力、抗腫瘤、抗炎、殺菌等[14]。黃精為百合科植物滇黃精、黃精或多花黃精的干燥根莖，具有滋腎潤肺，補脾益氣的功效[15-16]。砂仁復方對5-FU導致的胃腸菌群失調可能具有調節作用，但尚無確切的研究證明。本文利用5-FU建立大鼠腸道菌群失調模型，不同劑量砂仁復方灌胃，研究砂仁復方保護化療藥物5-FU所致大鼠腸道菌群失調作用，為臨床腫瘤治療中5-FU應用提供支撐，為砂仁復方的開發利用提供一定科學依據，同時為云南砂仁產業化發展作出貢獻。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品、樣本 雄性清潔級SD大鼠，體質量180～200 g，購于昆明醫科大學實驗動物學部，許可證號：SCXK（滇）k2015-002；砂仁（姜科植物砂仁Amomun villosum Lour的干燥成熟果實）；人參（五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey）和黃精（百合科植物滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl）均購于昆明市螺螄灣中藥材市場，3種藥材經云南中醫藥大學趙榮華教授鑒定為正品；雙歧桿菌四聯活菌片（思連康）產于杭州遠大生物制藥有限公司，批號：201703101；五氟尿嘧啶（5-FU）產于北京華邁科生物技術有限責任公司，批號：BJ160513212A；大鼠糞便（實驗結束當天收集鼠便，液氮速凍過夜，后轉移至-80℃冰箱貯存，備用）。

1.2 實驗方法

1.2.1 砂仁復方溶液的制備、動物分組及給藥 砂仁復方為砂仁、滇黃精、人參按1∶1∶1比例配伍而成，滇黃精用其提取液制成1 mL相當于1 g生藥流浸膏備用。砂仁、人參分別粉碎過100目篩備用。根據復方砂仁人服用每日劑量，折算大鼠的等效劑量約為生藥1.6 g/kg，為本實驗的中劑量，同時分別以生藥0.8、3.2 g/kg作為低劑量和高劑量。再配制0.32 g/mL砂仁復方高劑量藥液、0.16 g/mL砂仁復方中劑量藥液、0.08 g/mL砂仁復方低劑量藥液。

SD大鼠，隨機分成6組，每組9只：正常組（CON）、模型組（MOD）、陽性藥思連康組（BQVT）、砂仁復方低劑量組（AVCP-L）、砂仁復方中劑量組（AVCP-M）、砂仁復方高劑量組（AVCP-H）。

動物模型及各組給藥依據課題組前期實驗研究及杜靜等的方法，CON組每天1次生理鹽水灌胃（1 mL/100 g）至第19天，MOD組每天灌胃生理鹽水至第19天，并于第8、14天灌胃生理鹽水4 h后腹腔注射5-FU（35 mg/kg）。BQVT組每天灌胃生理鹽水至第7天，并于第8天開始灌胃思連康（0.45 g/kg），每天1次至第19天，且于第8、14天給藥4 h后，各腹腔注射 5-FU（35 mg/kg）1次。AVCP-L 組、AVCP-M組、AVCP-H組每天1次灌胃相應劑量的砂仁復方藥液，并在第8、14天給藥4 h后各腹腔注射5-FU（35 mg/kg）1次。于第19天收集每組3只大鼠糞便作為處理樣品，液氮速凍過夜，后轉移至-80℃冰箱貯存，備用。

1.2.2 SD大鼠糞便細菌16S rRNA測序 大鼠糞便樣品進行DNA提取，將細菌的16S rRNA（核糖體小RNA）基因V3可變區序列作為通用引物進行擴增，以引物 338F_806R （338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）進行PCR擴增。由美吉生物進行16S rRNA V3區測序得到有效數據（Effective Tags）上傳至i-Sanger生物信息云平臺。

1.2.3 運用i-Singer云平臺分析16S rRNA測序數據根據i-Singer云平臺分析軟件對各處理組腸道糞便菌群物種進行分析、注釋，對腸道菌群物種多樣性、不同分類學水平下菌群豐度分析進行分析比較，評價砂仁復方對化療藥5-FU所致大鼠腸道菌群變化的影響。

2 結果

2.1 腸道菌群豐度及Alpha多樣性分析 經測序分析，18份糞便樣品共獲得675 236條優化序列，序列平均堿基長度為440 bp，按照有效序列數以97%的序列一致性，將序列共聚類成3 933個操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。各組樣品的 OUT數量及多樣性指數見表1。各組OUT數量存在差異，AVCP-M>MOD>AVCP-H>AVCP-L>BQVT>CON。其中MOD的OTU數量顯著高于CON（P<0.05），AVCP-M、AVCP-H的OTU數量顯著高于CON（P<0.05）。豐度指數（Chao1）能估計菌群物種數，各組Chao1指數：MOD>AVCP-M>AVCP-H>AVCP-L>BQVT>CON，MOD及AVCL.M的Chao1指數均顯著高于正常組（P<0.05）。辛普森指數（Simpson）用來估算樣品中微生物多樣性的指數，指數越大，物種多樣性則越小，各組Simpson指數：MOD>CON>AVCP-H>BQVT>AVCP-L>AVCP-M，其中MOD的Simpson指數顯著高于 AVCP-L、AVCP-M（P<0.05）。

表1 樣品的OUT數量及多樣性指數表（±s，n=3）

表1 樣品的OUT數量及多樣性指數表（±s，n=3）

注：與正常組相比，▲P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。

A l p h a多樣性指數組數 O T U數量豐度指數C h a o 1 辛普森指數S i m p s o n正常組 C O N 4 3 7.6 7±6 7.0 0 5 0 9.6 2±7 9.0 4 0.0 7 9±0.0 3 1模型組M O D 5 1 6.0 0±3.6 1▲ 6 1 6.4 3±3 7.2 0▲ 0.1 0 0±0.0 6 8思連康陽性組 B Q V T 4 6 3.0 0±1 3.5 0 5 4 0.7 7±4 0.4 7 0.0 5 0±0.0 2 2砂仁復方低劑量 A V C P-L 5 0 6.6 7±1 1.5 0 5 9 2.5 0±2 6.9 3 0.0 3 6±0.0 1 4*砂仁復方中劑量A V C P-M 5 1 9.0 0±5 3.0 0▲ 6 1 2.7 8±5 8.6 8▲ 0.0 3 2±0.0 0 5*砂仁復方高劑量 A V C P-H 5 1 5.6 7±4 0.0 0▲ 5 9 3.1 2±6 2.8 5 0.0 7 4±0.0 2 2

2.2 稀釋曲線 以抽到的序列數同其所代表的OUT數構建稀釋曲線，如圖1所示，曲線未進入平臺期，說明隨著測序條數的增加，仍會產生新的OUT。以各樣品的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數構建維納指數（Shannon）曲線，如圖2所示，曲線已趨于平坦，表明盡管隨著測序量的增加，新的物種可能會出現，但微生物的多樣性已經不再隨之發生變化。說明本次測序數據量合理，可以反映樣本中絕大多數的微生物多樣性信息。

圖1 稀釋曲線SD大鼠糞便樣品Sobs稀釋曲線圖

圖2 多樣性曲線大鼠糞便樣品Shannon稀釋曲線圖

2.3 各分類學水平下相對豐度分析

2.3.1 門水平上各個處理組腸道菌群分析 表2所示，各處理組大鼠糞便微生物的16S rRNA進行測序，在被檢測出的10個菌門中，絕大多數（>95%）屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）。

表2 主要菌門在各組的相對豐度表（±s，n=3，%）

表2 主要菌門在各組的相對豐度表（±s，n=3，%）

注：與正常組相比，▲P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。

組別 擬桿菌門 厚壁菌門 厚壁菌門/擬桿菌門正常組 C O N 5 4.0 2 0 0±7.1 0 5 4 4 4.3 7 0 0±7.3 3 5 5 0.8 4 4 7±0.2 6 6 1 1模型組 M O D 6 2.9 0 3 3±8.2 3 4 0▲ 3 2.6 0 6 7±8.3 1 8 7▲ 0.5 3 5 6±0.1 9 7 5 3▲思連康陽性組 B Q V T 6 1.7 9 6 7±1 1.2 8 4 0 3 5.5 8 6 7±1 0.8 9 2 1 0.6 1 3 8±0.3 1 2 4 7砂仁復方低劑量 A V C P-L 5 6.8 1 3 3±7.8 4 3 1* 4 0.9 3 6 7±6.2 5 7 6* 0.7 4 1 4±0.2 2 6 3 5*砂仁復方中劑量 A V C P-M 5 8.5 2 0 0±7.6 7 2 5* 3 9.2 8 6 7±7.3 2 5 2* 0.6 9 1 3±0.2 3 0 2 2*砂仁復方高劑量 A V C P-H 6 2.4 0 6 7±9.2 2 2 0 3 3.8 1 3 3±7.7 2 6 0 0.5 6 3 5±0.2 2 0 9 6

厚壁菌門（Firmicutes）的構成比例：CON>AVCPL>AVCP-M>BQVT>AVCP-H>MOD，和擬桿菌門（Bacteroidetes）的構成比例剛好相反。厚壁菌門/擬桿菌門之比[Firmicutes（%）/Bacteroidetes（%）]：CON>AVCP-L>AVCP-M>BQVT>AVCP-H>MOD。

2.3.2 科水平上各個處理組腸道菌群分析 如表3所示，在被檢測出的42個菌科中，對各樣品中豐度大于95%的科進行了統計，小于5%的計入其它。所有糞便樣品的處理組中，相對豐度較高的科共檢測到7個。厚壁菌門芽孢桿菌綱：乳桿菌科（Lactobacillaceae）；厚壁菌門梭菌綱：消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）；擬桿菌門擬桿菌綱：擬桿菌科（Bacteroidaceae）、擬桿菌科（Bacteroidales-S24-7-group）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）。

表3 各組主要菌科相對豐度表（±s，n=3）

表3 各組主要菌科相對豐度表（±s，n=3）

注：與空白組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

組別 乳桿菌科 消化鏈球菌科 瘤胃菌科 毛螺菌科 擬桿菌科 擬桿菌科_S 2 4-7_g r o u p 普雷沃氏菌科C O N 0.2 8 2 9±0.0 9 0 6 0.0 0 9 3±0.0 0 2 6 0.0 5 9 3±0.0 0 0 4 0.0 8 3 2±0.0 3 8 1 0.0 5 4 0±0.0 3 8 2 0.2 1 7 1±0.0 3 3 6 0.2 5 5 8±0.0 5 4 2 M O D 0.0 8 6 1±0.0 8 1 9▲0.0 0 2 4±0.0 0 1 8 0.1 1 0 3±0.0 3 2 3 0.1 1 0 7±0.0 7 4 5 0.0 3 5 8±0.0 0 6 9 0.1 4 7 5±0.0 3 8 9 0.4 2 7 7±0.1 2 7 4▲B Q V T 0.1 7 6 5±0.1 3 6 8 0.0 0 5 4±0.0 0 3 0 0.0 9 5 8±0.0 1 9 5 0.0 6 5 7±0.0 1 6 1 0.0 6 1 8±0.0 2 2 6 0.2 2 6 6±0.1 5 2 1 0.3 1 3 6±0.0 9 5 3 A V C P-L 0.1 5 3 7±0.1 0 5 8 0.0 0 9 4±0.0 0 6 9 0.0 7 4 1±0.0 1 2 8 0.1 6 2 6±0.1 0 3 5 0.0 4 9 2±0.0 2 7 6 0.2 7 8 5±0.1 2 8 3 0.2 2 7 0±0.0 4 9 1*A V C P-M 0.0 7 1 6±0.0 2 6 4▲0.0 3 8 6±0.0 2 5 8▲▲**0.1 0 7 8±0.0 2 7 9 0.1 6 2 6±0.0 5 8 3 0.0 6 3 1±0.0 2 2 4 0.2 3 1 8±0.0 4 8 3 0.2 7 5 6±0.0 5 7 8 A V C P-H 0.0 6 6 5±0.0 4 8 0▲0.0 0 5 0±0.0 0 3 2 0.1 4 5 0±0.0 7 0 0▲ 0.0 9 2 7±0.0 5 1 9 0.0 4 3 9±0.0 2 0 9 0.1 4 4 0±0.0 0 6 7 0.4 2 2 3±0.1 0 3 0▲

乳桿菌科（Lactobacillaceae，屬厚壁菌門）比例：CON>BQVT>AVCP-L>MOD>AVCP-M>AVCP-H；MOD、AVCP-M、AVCP-H 3組乳桿菌科（Lactobacil laceae）的比例顯著低于 CON（P<0.05）；BQVT、AVCPL和CON 3組乳桿菌科（Lactobacillaceae）構成比例沒有差異性（P>0.05）。

消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae，屬厚壁菌門）比例：AVCP-M>AVCP-L>CON>BQVT>AVCP-H>MOD；AVCP-M 中消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）的相對豐度均顯著大于 CON、MOD（P<0.01）。

瘤胃菌科（Ruminococcaceae，屬厚壁菌門）比例：AVCP-H>MOD>AVCPM>BQVT>AVCP-L>CON；AVCP-H瘤胃菌科（Ruminococcaceae）的相對豐度顯著大于CON（P<0.05）；且AVCP-H的瘤胃菌科（Ruminococcaceae）相對豐度也顯著大于AVCP-L（P<0.05）。

普雷沃氏菌科（Prevotellaceae，屬擬桿菌門）比例：MOD>AVCP-H>BQVT>AVCP-M>CON>AVCP-L。同CON相比，MOD、AVCP-H兩組普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）相對豐度顯著大于 CON（P<0.05）；和MOD相比，AVCP-L普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）相對豐度顯著小于MOD（P<0.05）。

毛螺菌科（Lachnospiraceae）、擬桿菌科（Bacteroidaceae）、擬桿菌科 _S24-7_group（Bacteroidales_S24-7_group）3個菌科構成比例各組之間并沒有顯著性差異（P>0.05）。

2.3.3 屬水平上各個處理組腸道菌群分析 在被檢測出的121個菌屬中，對各樣品中豐度大于95%的科進行了統計，小于5%的計入其它。所有糞便樣品的處理組中，相對豐度較高的屬共檢測到13個，如圖3所示。

圖3 各處理組在屬水平上的豐度

CON組的優勢菌屬：乳桿菌屬（Lactobacillus 28.29%）、norank_f_Bacteroidales_S24-7_group（21.71%）；MOD組的優勢菌屬：Prevotella_9（22.2%）、norank_f_Bacteroidales_S24-7_group（14.75%）；BQVT組的優勢菌屬：norank_f_Bacteroidales_S24-7_group（22.66%）、Lactobacillus（17.65%）；AVCP-L 組主要優勢菌屬：norank_f_Bacteroidales_S24-7_group（27.85%）、Lactobacillus（15.37%）；AVCP-M 組主要優勢菌屬：norank_f_Bacteroidales_S24-7_group（23.18%）；AVCP-H組主要優勢菌屬：Prevotella_9（16.50%）、norank_f_Bacteroidales_S24-7_group（14.40%）；與CON組相比，化療藥5-FU組所致大鼠普雷沃菌屬Prevotella_9相對豐度增加明顯，乳桿菌屬Lactobacillus明顯降低，一個未知門類的菌屬norank_f_Bacteroidales_S24-7_group降低。與CON組相比，BQVT、AVCP-M普雷沃菌屬Prevotella_9相對豐度降低，AVCP-L普雷沃菌屬Prevotella_9比例增加。與CON組相比，其它各組乳桿菌Lactobacillus比例均降低，BQVT和AVCP-L的下降幅度低于其它各組。乳桿菌屬Lactobacillus的相對豐度：CON>BQVT>AVCP-L>AVCP-H>MOD>AVCP-M；和CON組相比，MOD（P<0.05）、AVCP-H（P<0.05）、AVCP-M（P<0.01）3組Lactobacillus屬的比例顯著低于空白組，BQVT及AVCP-L和空白組乳桿菌屬Lactobacillus的比例和CON沒有差異性（P>0.05）；對比CON，BQVT、AVCP-L及AVCP-M中1個未知門類的菌屬norank_f_Bacteroidales_S24-7_group的相對豐度增加，且AVCP-L組的增幅最大。

2.3.4 樣本層級聚類分析 如圖4可知：CON（A5、A2、A8）聚為一簇，模型組 MOD（B3、B1、B2）聚為一簇，且CON和MOD距離最遠；其它各組呈分散型介于二者之間，其中砂仁復方低劑量組AVCP-L（F8、F10、F1）、陽性藥思連康組 BQVT（C6、C4、C1）距離相對空白組CON的距離最近。

圖4 各組糞便菌群OTU水平上的樣本層級聚類分析

3 討論

健康腸道中微生物組成穩定、多樣性較高，飲食結構、藥物誘導等因素會對腸道微生物造成不同程度的影響，引起腸道菌群、多樣性改變等，可能引發不同疾病，潰瘍性結腸炎患者的腸道菌群物種數及多樣性都顯著低于健康人體[17]。本研究顯示，化療藥5-FU所致大鼠SD大鼠OTU數顯著大于正常SD大鼠；但化療藥5-FU所致大鼠的Simpson指數大于空白組，提示化療藥5-FU所致大鼠物種數增加，但物種多樣性低于空白組。

OUT數和Alpha多樣性指數能反應腸道菌群的數量及菌群的多樣性[18-19]，Huang Y[20]等采集白血病兒童腸內容物進行16S rRNA測序，發現白血病患兒OTU數等指數均顯著低于健康人群；本研究中OUT數和Alpha多樣性指數中Chao1指數分析結果幾乎吻合，由OUT數、Chao1指數分析表明MOD、AVCPM的物種數明顯高于CON；由Simpson指數，得出AVCPM、AVCP-L腸道菌群物種多樣性顯著高于MOD。提示化療藥5-FU所致大鼠腸道物種數明顯增加，但腸道菌群多樣性低于其它所有實驗組，且明顯低于砂仁復方低劑量組及砂仁復方中劑量組。

5-FU所致大鼠腸道糞便菌群擬桿菌門（Bacteroidetes）比例增加、厚壁菌門（Firmicutes）的比例減少、厚壁菌門/擬桿菌門[Firmicutes（%）/Bacteroidetes（%）]之比降低；這與陳曉慧[21]等的研究化療后，伴隨著腸道黏膜炎的發生，腸道菌群的種類和比例發生了顯著的變化，擬桿菌、腸桿菌等厭氧菌數量增加具有一定統一性。AVCP-L擬桿菌門（Bacteroidetes）比例、厚壁菌門（Firmicutes）的比例、厚壁菌門/擬桿菌門之比[Firmicutes（%）/Bacteroidetes（%）]之比都更接近CON，表明砂仁復方低劑量可能具有一定調節化療后擬桿菌門、厚壁菌門作用，并使之接近空白組。

砂仁復方中劑量可以顯著性調高化療藥5-FU所致Peptostreptococcaceae相對豐度的降低，并顯著高于MOD及CON；陽性藥思連康、砂仁復方低、高劑量對化療藥5-FU所致Peptostreptococcaceae相對豐度的降低也具有一定調節作用。孫志高[22]等認為，化療后腸道益生菌數量（豐度）減少。這與本實驗結果化療藥5-FU所致大鼠乳桿菌科相對豐度明顯低于CON具有一致性；陽性藥思連康和砂仁復方低劑量可能具有一定調高化療藥5-FU所致大鼠乳桿菌科（Lactobacillaceae）比例，使之接近正常水平。化療藥5-FU所致大鼠普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）相對豐度明顯增加，且砂仁復方低劑量可以顯著性降低5-FU腹腔注射后普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）比例的升高。砂仁復方低劑量可能主要通過調高乳桿菌科（Lactobacillaceae）、消化鏈球菌科比例以及降低瘤胃菌科（Ruminococcaceae）的比例來調節厚壁菌門的平衡；普雷沃菌屬普雷沃菌屬與抗生素相關性腹瀉（AAD）的發生和治療密切相關[23]。乳酸桿菌一直被認為是維持腸道健康的典型有益菌，可以促進乳糖不耐受人群消化乳糖、減少便秘和腹瀉、抑制腸道感染、減輕炎癥反應等[24]。相對于健康人群，克羅恩病患者糞便中瘤胃球菌數量增多[25]，本研究中，和空白組相比，其它實驗組瘤胃球菌數量均有不同程度的增加。同時，砂仁復方低劑量還能顯著性降低普雷沃氏菌科厭氧致病菌的比例，維持腸道微生態的平衡。另外，砂仁復方中劑量對消化鏈球菌科化療后比例降低有顯著的調高作用，并高于空白組。陽性藥思連康對益生菌乳桿菌科（屬厚壁菌門Lactobacillaceae）化療后比例降低的調高作用優于砂仁復方低劑量。

吳英韜[26]等的研究益生菌混合液對5-FU腹腔注射SD大鼠腸道菌群的調節作用，顯示聚類分析5-FU腹腔注射模型組單獨歸為一類，空白組及益生菌低劑量、益生菌高劑量歸為一類；與本研究聚類分析發現化療藥5-FU所致大鼠單獨歸為一類、空白組也單獨歸為一類、其它組介于二者之間；化療藥5-FU所致大鼠腸道菌群物種多樣性降低具有一致性。本研究樣本層級聚類分析可以看出，砂仁復方復方低、中劑量、陽性藥思連康對化療藥5-FU所致大鼠普雷沃菌 屬 Prevotella_9、 乳 桿 菌 屬 Lactobacillus、norank_f_Bacteroidales_S24-7_group相對豐度的變化，具有一定調節作用。陽性藥思連康和砂仁復方低劑量對化療藥5-FU所致大鼠Lactobacillus屬相對豐度顯著降低，具有明顯抑制作用。

Fang W[27]等研究葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的BALB/c小鼠結腸炎模型中腸道菌群多樣性降低、革蘭氏陰性菌增多。與本研究中5-FU所致大鼠norank_f_Bacteroida-les_S24-7_group比例降低32.06%，腸道菌群多樣性降低等具有一致性。故砂仁復方對化療藥5-FU所致大鼠腸道菌群多樣性降低等均具有明顯調節作用。