血虛風燥型特應性皮炎患者血清差異表達miRNA生物信息學篩選

劉學偉，許孟月，王建茹，王海燕，王子雯

1)河南中醫藥大學第一臨床醫學院 鄭州 450046 2)河南中醫藥大學第一附屬醫院皮膚科 鄭州 450000

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種慢性復發性炎癥性皮膚病，困擾著全球15%～20%的兒童和1%～3%的成年人[1]，在我國的發病率呈顯著上升趨勢[2-3]。AD主要表現為濕疹樣皮炎伴頑固瘙癢，目前認為其發病與遺傳、免疫、皮膚屏障功能障礙、微生物、環境等多種因素相關，但確切機制尚不清楚。現代研究[4]表明miRNA與AD的發病密切相關。中醫證候反映了疾病發展某一階段機體的病理變化，證候的出現可能與相關對應基因組的變化密切相關[5]。miRNA可通過調控靶基因參與各種生物過程使人體出現不同的癥狀與體征，miRNA特異性表達有可能為AD的診斷及中醫辨證分型提供客觀依據[6]。血虛風燥是AD的常見證候之一，目前關于血虛風燥型AD分子生物層面的研究較少，因此本研究利用高通量測序等分子生物學技術，篩選血虛風燥型AD患者與健康人血清差異表達的miRNA，挖掘血虛風燥型AD臨床辨證分型miRNA標志物，為血虛風燥型AD的中醫藥防治及尋求干預靶點和環節提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象研究對象為2018年1月至2019年8月通過河南中醫藥大學第一附屬醫院網站、宣傳海報形式招募的AD患者及健康志愿者。西醫診斷根據文獻[7]標準執行。中醫診斷參照國家中醫藥管理局制定的《中醫皮膚病證診斷療效標準》中血虛風燥型四彎風的診斷標準[8]。納入標準：符合AD診斷標準；符合血虛風燥證；年齡3～30歲；依從性好，自愿接受該試驗并簽署知情同意書。排除標準：妊娠或哺乳期婦女；伴有肝腎、心腦血管疾病，腫瘤，消化道、血液系統疾病等嚴重危及生命的原發性疾病及精神病患者；近1個月內應用糖皮質激素、免疫抑制劑類藥物治療及接受紫外線光療者。本研究方案獲得河南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會審批通過。

1.2 miRNA高通量測序采用miRNA提取試劑盒(美國凱杰)提取血清中的miRNA。用Cubit(美國賽默飛)和Bioanalyzer(美國安捷倫)分別對提取的miRNA進行質量和完整性檢測。采用Small RNA Library Prep Kit for Illumina文庫構建試劑盒(南京諾唯贊)制備miRNA文庫，在Illumina Hiseq 2500平臺進行高通量測序。測序數據質量評估采用FastQC 0.10.1進行分析，使用二代測序數據質量統計軟件Trimmomatic 0.30對測序原始數據去除接頭以及低質量序列等，得到有效數據。

1.3 差異表達miRNA的篩選采用Trimmomatic軟件對測序原始數據進行處理，得到合格序列，下載Rfam數據庫序列，利用BlastN軟件對序列進行比對，然后通過miRDeep2利用Reads比對信息進行注釋并計算表達量。miRNA差異分析使用Bioconductor軟件包的DESeq2 1.6.3進行分析。結果按照|log2FC|≥1.90且P<0.05進行篩選。

1.4 差異表達miRNA生物信息學分析選取上調與下調差異最大miRNA各3個進行靶基因預測及功能分析。為提高miRNA基因靶標預測的準確性，使用miRDB、Targetscan、miDIP分別預測miRNA的靶基因，并利用在線韋恩圖(Venny)繪制工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)篩選出3個網站共有的靶基因，作為目標基因的靶基因。運用R 3.6.2軟件ClusterProfiler包、Bioconductor包對靶基因進行GO分析和KEGG通路富集分析，設定P≤0.05為篩選條件。

2 結果

2.1 研究對象基本情況6例血虛風燥型AD患者年齡4～20(12.3±7.1)歲，男4例，女2例；6例健康志愿者年齡24～27(24.8±1.2)歲，男3例，女3例。

2.2 差異表達miRNA的篩選結果與健康人相比，血虛風燥型AD患者差異表達miRNA有74個(表1、2)，上調34個，其中表達前3位miRNA為miR-216b、miR-20b、miR-197；下調40個，其中miR-99、miR-1298-5p、miR-885是表達前3位的miRNA。

表1 上調miRNA列表

2.3 差異表達miRNA靶基因預測及生物信息學分析選取上調與下調差異最大的miRNA各3個(miR-216b、miR-20b、miR-197，miR-99、miR-1298-5p、miR-885)進行靶基因預測及功能分析。在miRDB、Targetscan、miDIP數據庫分別得到了2 553、5 458、3 764個預測靶基因，通過Venny獲得共同靶基因1 045個。運用R 3.6.2對1 045個共同靶基因進行功能注釋，GO分析顯示這些靶基因主要富集在17個功能，KEGG通路富集分析顯示這些基因主要富集在10個通路上(表3、4)。

表2 下調miRNA列表

表3 miRNA靶基因富集的GO分析結果

表4 miRNA靶基因富集的KEGG分析結果

3 討論

AD的疾病負擔在非致命皮膚疾病中位列首位，然而AD的發病機制尚未完全闡明，與AD有關的重要基因和通路有待進一步研究。本研究對比了健康人與血虛風燥型AD患者血清中差異表達的miRNA，經鑒定獲得了miR-216b、miR-20b、miR-197等34個下調的miRNA和miR-99、miR-1298-5p、miR-885等40個上調miRNA，顯示了與健康人相比血虛風燥型AD患者血清差異性miRNA表達譜。中醫認為血虛風燥型AD多因先天不足，稟賦不耐，脾失健運，復感風濕熱邪，蘊聚肌膚，反復發作，病久不愈，耗傷津液，營血不足，肌膚失養所致。中醫藥在治療AD具有自身特色及優勢，在辨證明確前提下，可有效改善癥狀，提高患者的生活質量，降低復發率，且不良反應少。已有研究[9-10]表明AD存在特異性表達的miRNA，對疾病診斷具有一定指示作用，但均未涉及中醫證候學。本研究中發現的差異表達miRNA可能成為協助血虛風燥型AD診斷的潛在生物標志物，為血虛風燥型AD的防治提供新的思路。

為了進一步了解這些miRNA及其靶基因在AD中發揮的作用，我們對上調與下調排名前3位的miRNA進行靶基因預測及生物信息學分析，GO分析顯示這些miRNA的靶基因主要參與了調控基因的表達與轉錄以及蛋白質的結合等。KEGG分析顯示差異表達miRNA被顯著富集于TGF-β信號通路、Hippo信號通路、PI3K-Akt信號通路等。其中TGF-β信號通路對免疫穩態與免疫耐受起重要作用，TGF-β在特應性疾病中發揮重要作用，研究[11]發現與普通人群相比，具有TGF-β信號通路紊亂疾病的人群發生特應性疾病風險增加。TGF-β可以促進調節性T細胞的分化，刺激肥大細胞和Th9細胞的分化，參與過敏性疾病的進程[12]。此外TGF-β可刺激成纖維細胞產生細胞外基質蛋白和蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶的合成和釋放，并促進成纖維細胞的激活，在傷口愈合和促進組織纖維化中起到重要作用，且TGF-β的過度表達與皮膚增厚有關[13]。此外，研究[14]發現母乳中較高水平的TGF-β可能與新生兒嬰兒濕疹有關。本研究中納入的血虛風燥型AD患者大多自嬰幼兒發病，病程較長，其重要的皮膚改變為皮膚肥厚粗糙或苔蘚樣變，提示TGF-β信號通路可能與血虛風燥型AD存在聯系。

綜上所述，本研究采用高通量測序技術篩選了血虛風燥型AD患者的miRNA表達譜，并對差異表達miRNA進行了靶基因預測及功能分析，結果表明血虛風燥型AD差異表達miRNA可能通過調控TGF-β、PI3K-Akt、Hippo等信號通路參與AD的發生發展過程，這些差異表達miRNA有望成為診斷血虛風燥型AD的候選生物標志物。本研究尚存在一定的局限性，納入樣本量較少且研究對象均為河南地區人群，因此篩選出的差異表達miRNA輔助診斷血虛風燥型AD的效能仍需擴大樣本和人群范圍進一步確證；預測的miRNA靶基因和相關信號通路在血虛風燥型AD病理過程中的作用，尚需進一步進行驗證。