LOOP環改良法全自動化制備11C-膽堿

李海峰，徐仁根，何玉林，陳志軍，張曉軍，李云鋼，張錦明

(1.江西省腫瘤醫院 核醫學科，南昌 330029； 2.中國人民解放軍總醫院 核醫學科，北京 100853)

11C-膽堿(11C-Choline，11C-CH)在臨床診斷膀胱癌、尿路上皮癌和前列腺癌等方面有著良好應用前景[1-6]。目前，臨床研究11C-CH的制備方法主要是C18柱固相合成法和液相合成法等[7-9]，液相合成法的合成時間較長，步驟較繁瑣，合成效率較低[10]，不能滿足臨床需求；C18柱固相合成法操作簡單，制備時間較短，已在臨床上推廣使用，取得較好的效果，但合成效率不理想[11]。文獻[12]使用LOOP環法合成11C-CH，LOOP環管徑較大，反應不充分，管壁產品殘留多，合成效率有待提高。本研究對國產11C-多功能合成模塊進行改進，使用管徑較小、比表面積大的聚四氟乙烯LOOP環(1 mm×0.5 mm×2 m)，尋求在國產模塊上全自動化LOOP環法合成11C-CH，與C-18柱固相法比較，實現合成方法簡單可靠，合成效率高的目的。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

自動化11C多功能合成模塊(PET-CM-3H-IT-Ⅰ)：派特(北京)科技有限公司；Endosafe-PTS細菌內毒素快速檢測儀：USA Charles River公司；分析天平：AB104G型號，Switzerland Mettler Toledo公司；活度計：CRC-15R型，USA Capintec公司；分析型HPLC儀、Sep-PakC-18柱、CM柱：美國Waters公司；無菌濾膜：Merck Millipore 公司。

1.2 試劑

N,N-二甲基乙醇胺、57% HI、LiAlH4四氫呋喃溶液(1 mol/L)：USA Sigma Aldrich公司；濃硫酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、無水乙醇：AR級，國藥集團化學試劑有限公司；0.9%生理鹽水：青島華仁藥業公司；滅菌注射用水：石家莊四藥有限公司；乙腈、丙酮：HPLC級，USA TEDIA公司。

2 實驗方法

2.1 11C-CH3I的合成

參考文獻[10]，液相法制備11C-CH3I：HM-20加速器經14N(P, ɑ)11C核反應在回旋加速器內產生11CO2，氮氣作為載氣將11CO2傳送到11C-多功能合成模塊，傳送完畢，開啟自動化程序，11CO2被N2載帶至反應管與0.2 mL四氫鋰鋁的四氫呋喃溶液(1 mol/L)反應，加熱并通入N2，除去THF，再加入0.3 mL 57%的氫碘酸，生成的11C-CH3I通入到LOOP環與前體反應。

2.2 產品的制備與純化

前體N,N-二甲基乙醇胺裝于LOOP環中，11C-CH3I通入到LOOP環中與前體進行反應，室溫反應1 min，用乙醇溶液將LOOP環內反應液帶至CM柱，經滅菌注射用水清洗，再用生理鹽水將產品淋洗至無菌瓶中，自動化合成系統圖示于圖1。

V6，V7，V8，V3，V14，V15，V4，V4_0，V2，V1，V9，V10，V13，V11，V11_1，V12—開關閥；R1，R2，R3，R4—核素活度計；T0—加熱；H1—注射圖1 11C-CH自動化合成系統Fig.1 Auto systhesis of 11C-CH

2.3 合成效率的影響因素

2.3.1溶劑 使用11C-CH前體量100 uL，選擇丙酮、乙腈、乙醇各100 uL及無溶劑等不同的溶劑條件，比較其合成效率。

2.3.2前體用量 取11C-CH不同前體量(5～300 uL)裝于LOOP環中，通入在線生成的11C-CH3I，室溫反應，尋求合適的前體量。

2.4 產品的實驗室質量控制

檢查產品外觀，精密pH試紙測試產品pH，使用Endosafe-PTS細菌內毒素快速檢測儀檢測產品的細菌內毒素，高效氣相儀檢測產品有機溶劑殘留，通過HPLC測量產品放化純度和比活度：分析產品11C-CH的分析柱為離子交換柱(150 mm×7.8 mm,pH=1～3)，流動相硫酸溶液(pH=3.0,0.01 mmol/L)，流速1 mL/min。

3 結果與討論

3.1 堿量對11C-CH反應的影響

前體N,N-二甲基乙醇胺本身提供堿催化，與11C-CH3I 反應生成11C-CH鹽，可以被富集在CM柱上，再用乙醇、水清洗有機雜質和無機雜質。整個合成過程沒有用到無機堿，無機堿的存在會破壞11C-CH鹽的生成而不易富集，因此，采用緩沖溶液調節產品pH。

3.2 溶劑

反應溶劑對合成效率影響的結果列于表1。由表1結果可知，乙腈、丙酮、乙醇溶劑中的反應效率均低于無溶劑，無溶劑反應更適合LOOP環法合成11C-CH，本研究認為丙酮、乙腈、乙醇不適合LOOP環法，合成11C-CH時選用無溶劑較好。

表1 溶劑對合成的影響Table 1 Effect of solvent on the synthesis

11C-CH的前體N,N-二甲基乙醇胺與11C-CH3I發生的是類似季銨鹽反應，N,N-二甲基乙醇胺本身為液體且極性較強，既可以做堿催化，也可以做溶劑，反應前體的濃度較高，更有利于取代反應的進行；加入不同的溶劑時，底物的反應濃度減小，不利于反應的進行。本研究采用11C-CH的前體本身為溶劑的LOOP環法來制備11C-CH。

季銨鹽具有鹽的性質，易溶于水而不易溶于非極性有機溶劑，而在加熱時易分解為叔胺和鹵代烷，熔點為270～272 ℃。季銨鹽與強堿如KOH、NaOH等作用得到含有季銨堿的平衡混合物。如果有醇類溶液，由于堿金屬的鹵化物難溶于醇，能將反應進行到底。季銨堿的堿性較強，不宜直接用于臨床研究。合成反應中，11C-CH前體與11C-CH3I發生的是SN2反應，受溶劑影響較大，溶劑極性越大，越有利于SN1反應，而對SN2反應不利。SN2反應過程中，由原來電荷比較集中的親核試劑變成電荷比較分散的過渡態，溶劑極性的增加使電荷集中的親核試劑溶劑化，降低反應效率。同時反應物濃度越高越有利于反應進行，在這幾類反應溶劑中，無溶劑反應合成效率最高，因而，本研究選用無溶劑進行反應。

3.3 前體用量

前體用量對11C-CH效率的影響示于圖2。11C-CH的前體本身既可以做堿催化，也可以做溶劑，11C-CH的前體量過小，N,N-二甲基乙醇胺不能有效的捕獲11C-CH3I，不利于反應進行；本研究使用的LOOP環可容納的體積為1.2 mL左右，11C-CH的前體量過大，并不會提升合成效率，而且有可能部分前體隨著氮氣流進入廢液，造成前體浪費。本研究的反應為類似季銨鹽的反應，其合成效率與前體濃度呈正相關，提高前體濃度可提升合成效率；但前體量過大會造成化學純度降低，同時浪費前體。為了保證合成效率、控制產品中前體含量，同時降低成本，選擇11C-CH前體用量60～150 uL為宜。

圖2 前體量對11C-CH合成效率的影響Fig.2 Effect of the precursor on the synthesis efficiency of 11C-CH

3.4 自動化合成及質量控制

優化11C-CH自動化合成條件為：自動合成器LOOP環中裝有60～150 uL的11C-CH前體N,N-二甲基乙醇胺，通入11C-CH3I，LOOP環處放射性計數穩定后，室溫靜置反應；打開V9、V13，用8 mL乙醇溶液將LOOP環內的反應液帶至CM柱，打開V10、V13，用10 mL水清洗產品，最后打開V11、V12，用8 mL生理鹽水將產品從CM柱上洗脫，經無菌濾膜進入收集瓶中。11C-CO2傳至LOOP環后，開啟自動合成程序，從11C-CO2到取代反應、純化至終產品，總計用時10 min。對產品抽檢進行質量控制，終產品的外觀、pH、HPLC檢測放化純度、細菌內毒素檢測、氣相色譜儀檢測溶劑殘留等質量控制結果均符合靜脈注射要求，并與C18柱固相法進行比較，結果列于表2。

3.5 LOOP環法與C18柱固相法的比較

目前，臨床上制備11C-CH的方法主要是C18柱固相合成法和液相合成法。1984年Diksic等[13]報道了11C-膽堿的合成，利用N,N-二甲基乙醇胺在100 ℃加熱條件下與11C-CH3I反應5 min，再用陽離子交換樹脂純化，經高壓液相色譜(HPLC)純化后得到11C-膽堿。產品需經加熱反應、HPLC純化后使用，此合成方法操作繁雜，不便于臨床推廣使用。Hara等[9]對Diksic制備方法進行了改進，合成過程仍需要加熱反應、HPLC純化得到11C-膽堿，不能滿足臨床需求。

Pascali等[8]采用C18柱固相合成法制備11C-膽堿，前體藥N,N-二甲基乙醇胺與11C-CH3I在C18柱上反應，再將粗產品吸附在離子交換柱CM柱上，進行簡單純化得到11C-膽堿。此C18柱固相合成法簡化了繁瑣的合成過程，減少加熱反應、HPLC純化等步驟，有利于臨床推廣使用，但其自動化程度不高，增加了合成時間。張錦明等[10，14]在Pascali C18柱固相合成法的基礎上進行了改進，將前體N,N-二甲基乙醇胺預裝于C18柱上，省去再裝載步驟，同時將注射器加淋洗液方法改成以氮氣流為動力，實現了自動化合成11C-膽堿，更有利于臨床應用，但合成效率一般。何山震等[11]通過優化標記的反應條件，以提高標記產率和生產的穩定性，但合成產率有待提高。龍婷婷等[15]經過工藝優化，使用自制的Light C18 柱，使11C-膽堿的標記產率得到較大提升，具有一定的臨床意義，在臨床推廣使用過程中，應保證自制的Light C18 柱安全性。高志麒等[16]將PET-CS-Ⅰ合成模塊小型化，使其體積縮小80%，合成模塊運行穩定，合成效率和質量同原模塊無差，且縮短傳輸管道后，管道內殘留減少，而改造后模塊比較專一化，不利于開發更多放射性藥物合成的用途。張政偉等[8]嘗試LOOP環法合成11C-CH，其自制LOOP環管徑較大，反應不充分，管壁產品殘留多，合成效率受到影響。

本研究使用LOOP環法合成11C-CH，尋求一種簡單可靠、合成效率高、全自動合成11C-膽堿的方法。先對國產11C-多功能合成模塊進行改進，使用的LOOP環材料為聚四氟乙烯。本研究優化了11C-CH的LOOP環法合成條件，并與常用的C18柱固相合成法進行比較，其合成效率明顯提高，結果示于圖3；兩種方法合成結果具體比較列于表3。

表3 11C-CH的合成結果Table 3 Results of synthesis of 11C-CH

改進后的LOOP 環法制備11C-CH，可有效提高合成效率，保證產品質量：1) LOOP 環法制備11C-CH過程中，LOOP 環可以重復、多次使用，同時減少了Sep-PakC-18柱的使用量，降低生產藥物合成成本；2) LOOP環，管徑較小，比表面積大，有利于11C-CH3I與前體充分反應，同時管壁產品殘留較少，合成效率提高，產品的產量大大提高；3) LOOP 環法還應用于制備11C-乙酸鹽、11C-蛋氨酸、11C-carfentanil等藥物的研究，擴展了制備方法使用范圍。

LOOP 環法制備11C-CH也有一定的局限性，產品制備后需要對LOOP環進行及時清洗，管壁殘留反應液可能會影響下次產品合成效率；LOOP環最佳重復使用次數也有待研究。

4 結論

本研究采用LOOP環法合成11C-CH，并優化了11C-CH的合成條件。采用前體N,N-二甲基乙醇胺本身做反應溶劑，同時提供堿催化，反應前體的濃度較高，更有利于取代反應的進行；確定11C-CH前體的使用量為60～150 uL；與文獻報道的LOOP環法及C18柱固相合成法相比，本研究的LOOP環法合成產量有較大提高；縮短了制備終產品所需的時間；減少了C-18柱的使用量，LOOP環可以重復、多次利用，降低了生產成本；LOOP 環法還應用于11C-乙酸鹽、11C-蛋氨酸等藥物研究，擴展了制備方法使用范圍；LOOP環法制備11C-CH的合成效率提高至(72.16±2.96)%(n=19,11C-CH3I未校正效率)；優化條件后合成的11C-CH質量控制結果符合靜脈注射要求。