注射用鹽酸吉西他濱及其原輔料中丙酮、二氯甲烷、吡啶殘留溶劑測定

熊欣，郭艷芳，鐘振華，夏紅英，劉貞，程奇珍

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

注射用鹽酸吉西他濱為處方藥，國家基本藥物目錄品種。由美國禮來公司研發，商品名為Gemzar，1995年在英國上市，1999年進口我國。鹽酸吉西他濱為二氟核苷抗代謝類藥，被美國FDA批準為非小細胞肺癌、膀胱癌、胰腺癌以及乳腺癌的一線化療藥［1-5］。主要引起骨髓抑制，胃腸反應、肝腎損害、輕度蛋白尿和血尿、皮膚毒性等不良反應［6-7］。

參照企業提供的合成工藝，結合相關研究資料［8-12］，本實驗建立了氣相色譜法測定注射用鹽酸吉西他濱中3種有機溶劑殘留量，并對收集到的樣品及其原輔料中丙酮、二氯甲烷、吡啶進行檢測。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent Agilent 7693型氣相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；MS105 型電子天平（精密度：十萬分之一，METTLER TOLEDO）；ML204型電子天平（精密度：萬分之一，METTLER TOLEDO）。

1.2 試藥

鹽酸吉西他濱（4家生產企業，8批次）；注射用鹽酸吉西他濱（8家生產企業，58批次）；丙酮［色譜純，永華化學科技（江蘇）有限公司，批號：20150505，含量≥99.0%］；二氯甲烷（色譜純，禹王集團，批號: 2015032501，含量≥ 99.0%）；吡啶（分析純，西隴科學股份有限公司，批號：190109 2）；N,N-二甲基甲酰胺（色譜純，Anaqua Chemical supply，批號：38Y1805HY）。

2 方法與結果

2.1 注射用鹽酸吉西他濱中丙酮、二氯甲烷與吡啶殘留量的測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：DB-5毛細管柱（30 m×0.53μm ×5 μm），序列號：125-5035；載氣：氮氣；程序升溫：起始溫度為40 ℃，維持10 min，以每分鐘20 ℃的速率升溫至160 ℃維持5 min，再以每分鐘40 ℃的速率升溫至200 ℃，維持15 min；進樣口溫度：200 ℃；檢測器溫度：250 ℃；進樣方式：直接進樣；進樣量：5 μL；氮氣流速：3 mL/min；分流比3∶1。

2.1.2 對照品溶液的制備 稱取丙酮、二氯甲烷與吡啶適量，加N,N-二甲基甲酰胺溶解并定量稀釋制成含每1 mL含丙酮0.5 mg、二氯甲烷60 μg與吡啶0.2 mg的混合溶液，濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品3瓶內容物，混合均勻，稱取適量（約含鹽酸吉西他濱0.5 g），置5 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 系統適用性試驗 取對照品溶液進樣，各成分峰之間的分離度均應符合要求。出峰順序依次為丙酮、二氯甲烷、吡啶，各峰之間的分離度均符合要求，系統適用性良好。

2.1.5 專屬性試驗 精密量取N，N-二甲基酰胺5 μL直接進樣，記錄色譜圖。結果表明，空白溶劑對3種溶劑的測定無干擾。

2.1.6 線性 精密稱取二氯甲烷0.122 0 g，置50 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取25 mL，置100 mL量瓶中，精密稱取丙酮0.505 5 g、吡啶0.214 0 g，置同一100 mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液。

精密量取混合對照品貯備液0.5、1.0、1.0、1.0、2.0、4.0 mL，分別置50、50、20、10、10、10 mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為混合線性系列標準溶液①②③④⑤⑥。按“2.1.1”色譜條件測定。以濃度（mg/mL）為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，丙酮濃度在0.050 55～2.022 00 mg/mL范圍內，線性關系良好；二氯甲烷濃度在0.006 1～0.244 0 mg/mL范圍內，線性關系良好；吡啶濃度在0.021 4～0.856 0mg/mL范圍內，線性關系良好。結果詳見表1。

表1 丙酮、二氯甲烷與吡啶線性方程表

2.1.7 精密度試驗 取線性系列標準溶液④，連續進樣6次，記錄色譜圖，記錄峰面積，計算峰面積RSD值。結果表明，丙酮、二氯甲烷與吡啶峰面積RSD值分別為0.4%、0.8%與1.1%，儀器精密度良好。

2.1.8 重復性試驗 取批號為160904樣品約0.95 g，精密稱定，重復取樣6次，分別置5 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，直接進樣，記錄色譜圖，計算檢出殘留溶劑的量。結果表明，該樣品檢出丙酮，平均殘留量為0.004 1%（n=6），平行性良好。

2.1.9 回收率試驗 精密量取線性系列標準溶液①5mL，置25 mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為回收率溶液①；分別精密量取混合對照品貯備液2、3 mL，分別置20、25 mL量瓶中，作為回收率溶液②③。

取本品內容物約0.47 g 9份，精密稱定，置5 mL量瓶中，第1～3號樣品分別加回收率溶液①溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液；第4～6號樣品分別加回收率溶液②溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液；第7～9號樣品分別加回收率溶液③溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，直接進樣，記錄色譜圖，計算回收率。結果顯示，丙酮、二氯甲烷與吡啶的平均回收率分別為96.7%、93.6%、90.5%（n=9），符合藥品質量標準分析方法驗證指導原則［8］中的回收率范圍要求（85%～110%）。

2.1.10 最低檢測限 精密量取線性系列標準溶液①1 mL，置100 mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，直接進樣5 μL，記錄色譜圖，二氯甲烷峰、吡啶峰信噪比約為3∶1。

精密量取線性系列標準溶液①5 mL，置10 mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，直接進樣5 μL，記錄色譜圖，丙酮峰信噪比約為3∶1。結果詳見表2。

表2 最低檢測限結果表

2.2 注射用鹽酸吉西他濱測定結果

采用擬定方法對來源于8家生產企業的58批次注射用鹽酸吉西他濱抽驗樣品進行檢測，結果表明，58批次樣品均未檢出吡啶與二氯甲烷；有51批次檢出丙酮，檢出率為87.9%，平均檢出量（以鹽酸吉西他濱計）為0.048%，結果均符合藥典要求。測定結果詳見表3。

表3 各企業樣品中丙酮檢出量情況統計表

本次抽驗樣品有同企業同批號樣品共9批次，結果表明，A企業批號為190102的3批次樣品中丙酮殘留量存在不同程度的批間差異，其中2批殘留量約為另1批殘留量的7倍，但檢出量均較小。因制劑生產過程中不使用丙酮，結果的差異可能與原料生產過程中是否混勻或制劑的貯藏條件有關；其余同批號樣品間丙酮殘留量的差異不大。結果詳見表4。

表4 各企業同批號樣品丙酮檢出量統計表

2.3 注射用鹽酸吉西他濱原料測定結果

本次抽驗共收集到8批次原料藥，涉及原料藥生產企業4家。根據4家企業提供的原料藥合成工藝，不同企業使用的起始物料、合成路線及提純工藝均不同，工藝中涉及使用的有機溶劑種類也有不同，同時原料藥企業注冊標準中的殘留溶劑檢查項對殘留溶劑的檢測方法以及檢測溶劑種類也存在較大差異。

對該8批次原料藥采用“2.1.1”色譜條件測定其殘留溶劑，結果顯示，8批次原料藥中均未檢出二氯甲烷與吡啶，僅來源于a企業的3批次原料藥（批號不同）中檢出丙酮，且該3批次原料分別由3家不同制劑企業提供，其含量分別為0.004 8%、0.009 6%、0.009 9%，平均含量為0.008 1%，均低于藥典規定限度。結果詳見表5。

表5 鹽酸吉西他濱原料中丙酮測定結果

原料藥中主要檢出丙酮，是源于吉西他濱在成鹽工藝中使用了甲醇溶劑，成鹽后用丙酮重結晶并洗滌。而制劑中檢出了丙酮，提示制劑中的溶劑殘留主要來源于原料藥。

2.4 注射用鹽酸吉西他濱輔料測定結果

通過發函調研，共收集到注射用鹽酸吉西他濱國內9家生產企業的處方信息。所有企業的處方使用的藥用輔料均為甘露醇（賦形劑）、醋酸鈉（pH緩沖劑）與注射用水（溶劑，最終除去），pH調節劑為鹽酸、氫氧化鈉或醋酸鈉，部分企業還使用了活性炭進行脫色、除熱原等。 此次抽檢樣品涉及的8家企業處方與原研處方的原輔料成分一致，但是1家企業（A）的甘露醇處方量與原研不同；2家企業（F、G）的醋酸鈉處方量與原研不同，并使用醋酸鈉調節藥液的pH值至規定范圍。對8家企業提供的26批輔料進行了檢測，結果三種殘留溶劑均未檢出。制劑企業提供的甘露醇、醋酸鈉及活性炭輔料中，均未檢出丙酮、二氯甲烷與吡啶。

3 結果與討論

通過比較制劑使用的原料來源及批號發現，（1）同一批次制劑中未測定出丙酮，而其使用的2批次原料中僅1批測出丙酮；（2）同一制劑企業所有樣品均有丙酮檢出，而其提供的原料未檢出丙酮；（3）同一制劑企業樣品中有部分批次有丙酮檢出，而其提供的3批原料均未檢出丙酮；（4）同一制劑企業樣品中有部分批次有丙酮檢出，而其提供原料檢出丙酮；（5）不同制劑企業采用同一原料企業提供的原料生產，原料中未檢出丙酮，而制劑存在部分批次有丙酮檢出、部分批次未檢出的現象。產生以上現象的原因，可能與制劑使用的原料與本試驗檢測的原料批號不同，而原料丙酮殘留量存在批間差異有關。制劑中的丙酮殘留量可能為原料帶入，且可能存在制劑生產過程或貯藏過程中造成丙酮的揮發或分解的現象。

因二氯甲烷與吡啶限度較低，頂空進樣方法靈敏度欠佳，故選擇直接進樣法對丙酮、二氯甲烷與吡啶進行檢測［13-14］。經方法學驗證，本試驗建立的定量檢測注射用鹽酸吉西他濱中3種有機溶劑的氣相色譜法，操作簡便、準確、經濟、重復性好，可用于注射用鹽酸吉西他濱中該3種溶劑殘留量的日常檢測，為制劑及原料藥中殘留溶劑的合理控制及其法定標準是否增訂殘留溶劑檢查項提供數據依據。結合原料及制劑測定結果，建議原料與制劑生產企業優化生產工藝，嚴格控制內部工藝的穩定性，提高批間批內精密度。